一种用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物工程及生物医药技术领域，具体属于分子生物学和肿瘤学领域，更具体涉及一组用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒。该试剂盒包括固相载体和包被于固相载体上的肿瘤相关抗原TVP23C、PAQR5和NUBPL，还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。本发明专利技术试剂盒对食管癌的检测灵敏度达91.46%，检测特异性达83.75%，适用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒
本专利技术属于生物工程及生物医药
，涉及分子生物学和肿瘤学领域，更具体涉及一组用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒。
技术介绍
食管癌是常见的消化道肿瘤，发病率很高，仅次于胃癌。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。在我国农村，食管癌是发病率最高的肿瘤。食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，食管癌的发生与亚硝胺类化合物慢性刺激，炎症与创伤，遗传因素以及饮水、粮食和蔬菜中的微量元素含量有关。总的来说食管癌的发病因素可分为环境和基因两大类。随着人们生活水平的提高，生活环境得到改善，环境因素对食管癌的发病影响作用越来越小，而基因这一致病因素则越发显得重要。食管癌的发生发展是一个多因素、多阶段、缓慢的发展过程，这些基因均与早期食管癌和癌前病变有关，多个肿瘤相关基因联合检测的变化有利于对食管癌无症状高危人群起到一定的预警作用。传统上，“高发区、40岁以上、男性、吸烟、饮酒、家族史阳性的无症状人群”被笼统界定为“食管癌高危或高风险人群”，也是食管癌早期筛查的主要对象。现已证实食管癌早期发现手术治疗切除率可达100％，5年生存率可达90％以上，但是目前就诊患者多数已达中晚期，远期疗效尚欠满意。并且针对食管癌早期诊断的多种联合检测方法以及相应试剂盒的应用还比较少见。食管癌无症状高危人群的早期发现尤为重要，但在胃镜等筛查时，受检者人群需要忍受一定的痛苦，不易顺从,且检测机器偏贵,偏远地区不能普及胃镜检查。因此，目前迫切需要有新的低成本检测技术和设备来满足在全国尤其是食管癌高发区的普查。食管癌是由多种基因编码的蛋白参与的复杂的多阶段演进过程，是环境和遗传互作的结果，人体受到各种物理或生化因素刺激，如亚硝胺导致DNA烷基化损伤，微量元素缺乏等，均可导致食管鳞状上皮基底细胞过度增生，进一步成为不典型增生，最终发展为早期浸润癌。食管癌的发生、发展过程中涉及多个癌基因、抑癌基因的突变，产生各种酶学的改变，表现为多基因、多因素、多步骤的协同作用。专利技术人所在研究机构历年来搜集了30余万例食管鳞状细胞癌患者相关信息，利用分子机制筛选食管癌特异标志物，建立高危人群和食管癌早期发现的分子标志物筛查体系，并在此基础上进行分子标志物筛选，同时结合专利技术人所在研究机构近期开展的一项研究，采用蛋白质微阵列芯片技术，对一万余例食管癌患者以及健康志愿者的外周血进行配对研究，发现了数种与食管癌的发生有关的抗原蛋白，并从中筛选出了TVP23C、PAQR5、NUBPL这三种与食管鳞状细胞癌早期病变有关的抗原作为早期诊断指标，基于这三种抗原标志物，开发一种具有高灵敏度和高特异性的用于早期食管癌筛查的试剂盒，可有效进行食管癌早期预警，对于提高早期食管癌的发现率，降低食管癌的死亡率具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题和不足，本专利技术的目的在于提供一种用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒。基于上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种肿瘤相关抗原TVP23C、PAQR5、NUBPL的组合在制备用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒，试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，肿瘤相关抗原由TVP23C、PAQR5、NUBPL组成。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。更加优选地，样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；终止液为10wt％的浓硫酸；洗涤液为pH=7.4且含0.05v％吐温-20的PBST缓冲液。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，第二抗体带有可检测的标记物。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，标记物为辣根过氧化物酶。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，第二抗体为RecA蛋白。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，阳性对照血清为TVP23C阳性对照血清，阴性对照血清为TVP23C阴性对照血清。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，TVP23C阳性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测TVP23C抗体均为阳性的食管癌患者血清；TVP23C阴性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测TVP23C抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。本实验室的近期研究发现TVP23C抗原在食管癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且抗TVP23C抗体在食管癌患者血清中具有较高的阳性率。本专利技术选择TVP23C抗体阳性血清作为阳性对照，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，固相载体为酶标板。更加优选地，固相载体优选为48孔酶标板（共8行6列）；48孔酶标板按照图1所示的布局设计包被TVP23C、PAQR5、NUBPL这三种肿瘤相关抗原，其中，每两行包被有一种抗原，每种抗原包被于两行共14个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入本专利技术ELISA试剂盒的点样孔中，达到同时检测出该血清样品中三种肿瘤相关抗原表达水平的目的。其中，48孔酶标板上设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，空白对照孔中包被不含抗原的包被液，阳性对照孔和阴性对照孔中均包被TVP23C抗原。本专利技术液体活检ELISA试剂盒中48孔酶标板的抗原包被布局图（图1）中，抗原名称表示该孔包被了此抗原，通过向该孔中加入待测血清，用于检测待测血清中相应抗体的表达水平；“阳性”表示阳性对照孔，向阳性对照孔中加入的为阳性对照血清；“阴性”表示阴性对照孔，向阴性对照孔中加入的为阴性对照血清；“空白”表示空白对照孔，空白对照孔中不加入待测血清，其余操作均各孔均相同，空白对照用于反映试验过程中的背景值。根据上述液体活检ELISA试剂盒，优选地，液体活检ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。同一血清样本经过稀释后加入酶标板，可以达到同时检测出该血清样品中TVP23C、PAQR5、NUBPL这三种抗原对应抗体的表达水平。与现有技术相比，本专利技术取得的积极有益效果如下：（1）本专利技术首次将TVP23C、PAQR5、NUBPL这三种肿瘤相关抗原作为一个组合，联合用于检测人血清中上述三种抗原对应抗体的表达水平，可以有效检测食管癌，尤其是早期食管癌，本专利技术试剂盒对早期食管癌的检测灵敏度高达91.46%（即早期食管癌患者中应用这三个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确地诊断为早期食管癌的比率为91.46%），检测特异性达到了83.75%（即非食本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肿瘤相关抗原TVP23C、PAQR5、NUBPL组合在制备用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.肿瘤相关抗原TVP23C、PAQR5、NUBPL组合在制备用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检试剂盒中的应用。


2.一种用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原由TVP23C、PAQR5、NUBPL组成。


3.根据权利要求2所述的液体活检ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。


4.根据权利要求3所述的液体活检ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。


5.根据权利要求4所述的液体活检ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。


6.根据权利要求3～5任一所述的液体活检ELIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立东，杨媛啧，赵学科，宋昕，王苒，李留玉，李贝，范宗民，韩雪娜，雷玲玲，常志伟，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41