一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法技术

一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法。该方法包括：将已知浓度的整合子基因intI1标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应提取DNA，以此DNA为模板，利用设计的正向引物和反向引物对此DNA进行定量PCR扩增，并记录循环数；将获得的循环数，根据定量PCR测定目的基因intI1质粒标准样品的标准曲线；运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准样品做出目的基因的标准曲线；确定大气环境样品中一类整合子基因intI1的循环数，并根据标准曲线计算基因intI1的含量。本发明专利技术提供的目的基因引物序列和方法可以对大气环境样品中一类整合子基因intI1进行快速精确定量。

【技术实现步骤摘要】
一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法
本专利技术涉及环境微生物学领域，具体涉及一种检测大气环境中可移动遗传因子intI1的方法。
技术介绍
抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)所产生的能够抑制其它类微生物生长、生存的次级代谢产物，以及用化学方法合成或半合成的化合物，几乎所有种类的抗生素都是基于在环境微生物中自然发现的抗生素结构，主要用于治疗细菌感染疾病。由此导致的抗生素耐药细菌感染增加和抗生素耐药基因的多环境传播，使得世界正面临着严重的健康威胁。随着抗生素在临床抗感染治疗上的广泛使用，细菌耐药性问题日益严重，细菌间基因的水平转移是细菌多重耐药性形成和广泛传播的重要原因。整合子系统具有捕获和表达外来耐药基因盒的能力，细菌可以通过该系统中的整合酶基因intI1编码的整合酶不断的从周围环境中捕获和积累耐药基因盒，形成巨大的耐药基因多基因座。整合子可存在于质粒、转座子等可遗动基因组件上，在同种或不同种属的细菌之间进行基因的水平转移，且整合子在多重耐药菌的形成及耐药基因的水平扩散中起重要作用。然而，目前对大气环境中的intI1研究较少，intI1可携带抗生素抗性基因通过空气传播方式进入人体，影响人类健康。
技术实现思路
本专利技术目的是解决大气环境中对不可培养微生物的基因无法进行检测的问题，提供了一种能够快速精确地检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法。实时定量PCR技术是一种利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增过程中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析方法。此方法对于检测环境大气中含量较少细菌所含的基因有较好的效果，因此采用实时定量PCR技术研究大气环境中整合酶基因intI1对人体健康及环境的影响具有重要理论和实践意义。本专利技术的技术方案一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：正向引物(SEQIDNO1)：GGCTTCGTGATGCCTGCTT；反向引物(SEQIDNO2)：CATTCCTGGCCGTGGTTCT。一种检测大气环境中可移动遗传因子——一类整合子基因intI1的方法，具体包括：(1)将已知浓度的整合子基因intI1的标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应；提取标准样品中的DNA，以此提取的DNA为模板，利用以上设计的正向引物(SEQIDNO1)和反向引物(SEQIDNO2)对此DNA进行定量PCR扩增，并记录达到荧光阈值时的循环数；所述定量PCR的反应体系为25μL：12.5μL浓度为1×的qRTqPCRSuperMix溶液，0.3μL0.2μM的正向引物，0.3μL0.2μM的反向引物，10.9μLddH20，1.0μLTemplateDNA。所述DNA的提取方法为：用MO-BIOPowerSoilDNAIsolationkit试剂盒提取。采用该方法提取DNA能够在较短时间内纯化DNA，并适用于各种困难环境中的DNA提取，可从含微生物量较少的大气样品中提取足够用的DNA量。其专利技术可去除百分之百的腐殖质和PCR抑制剂。(2)将步骤(1)中PCR定量扩增获得的循环数，根据定量PCR测定目的基因intI1质粒标准样品的标准曲线；运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准样品做出目的基因的标准曲线，以标准样品的拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，使标准质粒浓度分别为：102、103、104、105、106、107，108，确保R2>0.99，扩增效率在90％-110％之间时为有效曲线；所述目的基因intI1质粒标准样品的制备方法如下：目的基因intI1质粒标准样品的制备：通过以上设计的正向引物(SEQIDNO1)和反向引物(SEQIDNO2)，PCR扩增获得目的基因PCR产物，然后利用胶回收试剂盒获得目的DNA片段。将纯化后的DNA片段运用载体加入到感受态大肠杆菌细胞DH5α中，加入不含氨苄的LB培养基中培养，复苏1h后，在含有氨苄的固体LB培养基中培养一夜后，通过蓝白斑筛选法选取单菌落白斑，加入到含氨苄的LB液体培养基培养12h。用质粒提取试剂盒提取质粒，切胶后送样测序检测插入基因片断序列。符合要求的质粒作为标准样品。(3)按照步骤(1)所述方法确定大气环境样品中一类整合子基因intI1的循环数，并根据步骤(2)的标准曲线计算基因intI1的含量。在相同体系下，对未知DNA样品进行实时定量PCR检测，获得未知样品的循环数(Ct值)值，代入上述标准曲线中计算得到待测样品目的基因DNA的初始浓度。确保R2>0.99，扩增效率在90％-110％之间时为有效曲线。本专利技术的优点和有益效果：(1)本专利技术利用MO-BIOPowerSoilDNAIsolationkit试剂盒，百分之百去除PCR反应抑制物，大大提高PCR反应的灵敏度和成功率。提取纯净的DNA可直接用于PCR等下游实验。(2)通过普通PCR反应，可以确定大气环境中一类整合子基因intI1的存在与否；通过实时定量PCR反应，可以确定大气环境中一类整合子基因intI1含量，为大气环境中目标DNA的研究提供技术指导；(3)该方法提取DNA所需的时间比传统的提取DNA的方式短，DNA纯度较高，有利于后期DNA检测，实用性强，可靠性高。附图说明图1是提取大气环境样品中DNA的电泳图谱；第1泳道：学校大气环境样品中微生物DNA，第2泳道：商场大气环境样品中微生物DNA，第3泳道：医院大气环境样品中微生物DNA，第4泳道：车站大气环境样品中微生物DNA，第5泳道：居民区大气环境样品中微生物DNA空白泳道：阴性对照。图2是提取大气环境样品中DNA扩增目标基因intI1电泳图谱；第1泳道：学校大气环境样品中的目标基因intI1，第2泳道：商场大气环境样品中的目标基因intI1，第3泳道：医院大气环境样品中的目标基因intI1，第4泳道：车站大气环境样品中的目标基因intI1，第5泳道：居民区大气环境样品中的目标基因intI1空白泳道：阴性对照。图3是目标基因intI1定量标准曲线。具体实施方式下面结合附图按照具体实施案例，对本专利技术进行进一步的阐述。实施例1：大气环境样品中DNA的提取。利用MO-BIOPowerSoilDNAIsolationKit试剂盒提取大气环境样品中DNA的步骤如下：(1)将滤膜放入含50ml1×PBS缓冲液烧杯中，4℃下200×g离心3h。(2)轻微涡旋后将重悬液倒入装有0.2um的Supor200PES膜的漏斗中，2min内过完500ml。(3)待PES膜风干后将膜剪碎，放入试剂盒所带的试管中，加入60μL的SolutionC1，以最大转速涡旋15min，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，碱基序列为：/n正向引物：GGCTTCGTGATGCCTGCTT；/n反向引物：CATTCCTGGCCGTGGTTCT。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，碱基序列为：
正向引物：GGCTTCGTGATGCCTGCTT；
反向引物：CATTCCTGGCCGTGGTTCT。


2.一种利用权利要求1所述的目的基因引物序列检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法，其特征在于，包括：
(1)将已知浓度的整合子基因intI1的标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应；提取标准样品中的DNA，以此提取的DNA为模板，运用权利要求1中的正向引物和反向引物进行PCR定量扩增，得到PCR产物的循环数；
(2)将步骤(1)中PCR定量扩增获得的循环数，根据定量PCR测定目的基因intI1质粒标准样品的标准曲线；运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准样品做出目的基因的标准曲线，以标准样品的拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，使标准质粒浓度分别为：102、103、104、105、106、107，108，确保R2>0.99，扩增效率在90％-110％之间时为有效曲线；
(3)按照步骤(1)...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪庆，郭绍月，王丽涛，杨卫华，杨光，鲍玲玲，罗景辉，
申请(专利权)人：河北工程大学，
类型：发明
国别省市：河北;13