一种牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术具体涉及一种牛支原体的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。牛支原体是一种严重威胁牛养殖业的病原体，目前尚没有有效的治疗药物及疫苗，提供高效精确的检测方法对于牛支原体的防治具有重要意义。本发明专利技术研究表明P59蛋白编码基因序列在牛支原体种内高度保守且与其他物种相似度低，是一种良好的检测标志物。具体的，本发明专利技术还提供一种基于P59蛋白的SYBR Green I荧光定量PCR的检测方法，经验证，具有良好的检测特异性及灵敏度。该方法的建立为牛支原体病的快速、准确、高精度检测提供了新的诊断方法，为牛支原体的防控提供了一定保障。

【技术实现步骤摘要】
一种牛支原体的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于支原体检测
，具体涉及一种牛支原体检测方法、试剂盒及牛支原体P59蛋白作为检测标志物的应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。牛支原体(Mycoplasmabovis)易引起牛的局部炎症，如肺、乳房、生殖道、关节发炎、各类呼吸系统疾病，甚至引起母牛不孕，是一种严重威胁牛养殖业的病原体。上个世纪八十年代以来，牛支原体相关疾病快速蔓延到多个国家及地区的牛群，严重制约了畜牧业和经济的快速增长。据报道，欧洲每年25.1％～33.8％的犊牛感染牛支原体肺炎，损失高达1.43亿～1.93亿欧元。英国每年有190万头左右的牛感染牛支原体肺炎。据报道，美国牛场的感染率达到了71％，因牛支原体引起的疾病如牛呼吸系统疾病、肺炎等产生的损失高达1.40亿美元。继2008年之后，我国的多个地区也相继爆发了由牛支原体引起的传染病，主要症状有发热、咳嗽、流鼻涕等。由于目前没有效果理想的治疗药物及疫苗，并且支原体具有高度的传染性，对于牛支原体进行快速、精准的鉴别有助于早期发现及提供及时的治疗。目前，牛支原体的诊断方法还没有国际化的标准，我国对牛支原体的诊断方法主要是从病原分离培养后鉴定，血清学诊断和分子生物学三个大方向对该病原进行检测、鉴定。牛支原体的分离培养主要是将感染牛支原体的患病牛肺脏等组织研磨后，将研磨均匀悬液通过0.45μm滤膜接种于液体培养基中进行培养，该方法主要用于分离单独菌株，但是分离培养需要时间较多，不能够作为一种常规快速的诊断方法。血清学诊断牛支原体病原的方法主要包括酶联免疫相关技术(如ELISA、免疫酶技术等)、间接血凝抑制实验、化学发光分析等，血清学检测诊断虽然具有一定的灵敏性，但是容易出现假阳性的情况。常规PCR检测方法的灵敏度不够，有时肉眼观察具有明显临床病理变化的样品组织，却检测不出阳性条带。基因诊断技术中，所述PCR方法为鉴别支原体的主要技术，但由于牛无乳支原体和牛支原体的16SRNA具有极高的同源性，故利用PCR扩增16SRNA无法区分上述两种病原体。
技术实现思路
针对
技术介绍
中的记载，本专利技术的技术目的在于提供一种精确、高效的牛支原体检测方法。本专利技术通过生物信息学方法对牛支原体P59蛋白编码基因MBOVPG45_0018分析发现，该基因序列具有高度保守性且与其他物种相似度低，作为检测靶点具有良好的特异性。本专利技术进一步的针对P59蛋白进行引物设计，建立了一种牛支原体SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，经验证具有良好的检测特异性和灵敏度。基于以上技术效果，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面，提供牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用。本专利技术中所述P59蛋白，在NCBI中登记号为ADR25304.1或WP_013456518.1。经验证，所述P59蛋白基因序列在牛支原体种内高度保守且与其他物种相似度均低于50％，这启示牛支原体蛋白P59具有一定的特异性，作为牛支原体检测标志物有望提高检测精确度，降低假阳性结果出现概率。本专利技术第二方面，提供一组序列，所述序列组如下：SEQIDNO:1ACTTTAAATTGGTTGCTGCC，SEQIDNO:2GTTCCTAAAGAGTGTTGATATG，SEQIDNO:3TTACGCAAGAGAATGCTTCA，SEQIDNO:4TAGGAAAGCACCCTATTGAT。本专利技术第三方面，提供一种牛支原体的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括P59蛋白检测试剂。本专利技术第四方面，提供一种牛支原体的检测方法，所述检测方法通过检测P59蛋白的实现牛支原体的检测。以上一个或多个技术方案的有益效果是：本专利技术研究建立了牛支原体SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，该方法灵敏度是常规PCR方法的100倍，不与多种病原菌发生交叉反应，变异系数小于3％，对牛鼻拭子和牛奶样品的阳性检出率均高于普通PCR。该方法极大地缩短了检测时效，敏感性较血清学方法更高和且特异性更高。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例1中牛支原体p59蛋白编码基因进化树分析图；图2为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR检测方法标准曲线图；图3为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR检测方法溶解曲线；图4为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR特异性试验结果；图5为实施例1中所述牛支原体荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验结果图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。正如
技术介绍
所介绍的，针对现有技术中存在的不足，为了解决如上的技术问题，本专利技术提出了P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用以及牛支原体的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法。本专利技术第一方面，提供牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用。优选的，所述P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用包括通过免疫学方法及基因诊断方法通过检测P59蛋白的含量对牛支原体进行检测。在一些实施方式中，所述免疫学方法包括采用免疫印迹、酶联免疫吸附测定方法或免疫组化方法对待测个体的血清、组织或分泌物进行检测。在一些实施方式中，所述基因诊断检测方法包括采用核酸扩增方法检测待测个体血清、组织或分泌物中的P59。本专利技术第二方面，提供一组序列，所述序列组如下：SEQIDNO:1ACTTTAAATTGGTTGCTGCC，SEQIDNO:2GTTCCTAAAGAGTGTTGATATG，SEQIDNO:3TTACGCAAGAGAATGCTTCA，SEQIDNO:4TAGGAAAGCACCCTATTGAT。本专利技术第三方面，提供一种牛支原体的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括P59蛋白检测试剂。优选的，所述P59蛋白检测试剂包括基于抗原-抗体识别作用对P59蛋白进行识别的蛋白类试剂。优选的，所述P59蛋白检测试剂包括用于核酸扩增的核苷酸引物序列。进一步优选的，所述P59蛋白检测试剂包括第二方面所述序列。本专利技术第四方面，提供一种牛支原体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用。/n

【技术特征摘要】
1.牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用。


2.如权利要求1所述牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用，其特征在于，所述P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用包括通过免疫学方法及基因诊断方法通过检测P59蛋白的含量对牛支原体进行检测。


3.如权利要求2所述牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用，其特征在于，所述免疫学方法包括采用免疫印迹、酶联免疫吸附测定方法或免疫组化方法对待测个体的血清、组织或分泌物进行检测。


4.如权利要求2所述牛支原体P59蛋白作为牛支原体检测标志物的应用，其特征在于，所述基因诊断检测方法包括采用核酸扩增方法检测待测个体血清、组织或分泌物中的P59。


5.一组序列，其特征在于，所述序列组如下：
SEQIDNO:1ACTTTAAATTGGTTGCTGCC，
SEQIDNO:2GTTCCTAAAGAGTGTTGATATG，
SEQIDNO:3TTACGCAAGAGAATGCTTCA，
SEQIDNO:4TAGGAAAGCACCCTATTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亮，杨宏军，朱曼玲，杨美，楚会萌，张云飞，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37