一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法技术

本发明专利技术提供了一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增；所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和poly dT。本发明专利技术在逆转录引物中添加条形码序列对单细胞全长RNA进行逆转录，实现了对不同单细胞来源的序列进行标记，对不同来源的DNA扩增产物混合达到了第三代测序平台对模板量的要求，利用第三代测序平台实现了对全长转录本的精确测序。

【技术实现步骤摘要】
一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法
本专利技术属于单细胞测序
，涉及一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法。
技术介绍
第二代测序技术(Next-generationsequencing，NGS)的出现将分子生物学研究推向了一个高通量发展的时代，利用NGS产生了大量转录组数据，广泛应用于基础生物学研究和医疗健康领域。传统的测序方法需要大量的起始细胞以获得足够的测序模板，得到的数据也是所有细胞混合的结果，特别是在RNA测序中，细胞间的差异淹没在了平均值中。单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)应运而生，近十年来，基于NGS平台的单细胞转录组测序取得了长足的进步，克服了研究稀有生物材料的挑战，同时揭示了生物样品的异质性，促进了系统发育和癌症异质性等研究领域的发展。Drop-seq(MacoskoEZ,etal.HighlyParallelGenome-wideExpressionProfilingofIndividualCellsUsingNanoliterDroplets.Cell.2015；161(5):1202-1214；BageritzJ,etal.Single-CellRNASequencingwithDrop-Seq.MethodsMolBiol.2019；1979:73–85；ZhengGX,etal.MassivelyParallelDigitalTranscriptionalProfilingofSingleCells.NatCommun.2017；8:14049.)和Microwell-seq(Codina-FauteuxVA,etal.PHACTR1SplicingIsoformsandEqtlsinAtherosclerosis-RelevantHumanCells.BMCMedGenet.2018；19(1):97.)等高度并行的scRNA-seq方法使分析人类细胞图谱(HCA)成为可能。然而由于NGS测序平台的技术原因，读长基本不超过500个碱基，对于平均长度为1000个碱基的信使RNA，需要进行测序数据拼接才能推断得到完整的转录本信息，难以获得不同可变剪切的转录本信息。第三代测序平台(TGS)克服了NGS测序平台读长短的缺点，已经应用于细胞提取总RNA分子的直接测序。然而，TGS测序策略需要大量的原始材料来构建文库，而这些材料无法从单个细胞中直接获得。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法，所述方法在逆转录阶段对获得的单细胞全长转录本进行条形码标记，并利用第三代测序平台进行测序，可以实现高精度检测单细胞全长转录本的技术效果。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种单细胞转录组的处理方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增。优选地，所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和polydT。本专利技术中，在逆转录引物中添加条形码序列，对不同单细胞来源的RNA进行标记，得到带有条形码的cDNA，将不同来源的产物混合后可以通过条形码序列追溯最初的单细胞来源，利用第三代测序平台实现了对单细胞全长转录本的精确测序，解决了第三代测序平台对原始样本需求量大的技术问题。根据本专利技术，所述逆转录引物由三个部分组成：5’端的锚定序列用于向cDNA添加相同的末端序列，有利于后续利用相同的锚定引物进行不同cDNA序列的PCR扩增；中间的与第三代测序平台兼容的条形码序列，为不同来源的单细胞转录本添加不同的标签以进行数据区分；3’端的多个胸腺嘧啶(T)，可以有效结合到mRNA的poly(A)尾上，对转录本进行逆转录。优选地，所述条形码序列与第三代测序系统兼容，所述第三代测序系统例如可以是单分子即时DNA测序、Heliscope单分子测序、基于荧光共振能量转移的即时DNA测序、纳米孔单分子测序或离子流半导体测序中的任意一种，优选为纳米孔单分子测序。优选地，所述条形码序列与纳米孔单分子测序系统兼容。由于第三代测序技术的单碱基准确度略低，本专利技术设计了较长的条形码序列，所述条形码序列不包含连续三个及以上的相同碱基，并且回避第三代测序偏好的错误模式，不同条形码序列的差异足够大(至少具有10个碱基的错配)；另外，采用第三代测序技术对PCR扩增后的转录本进行测序，相当于对相同单细胞来源的转录本进行多次测序，以条形码序列为标签进行数据分析并纠错，弥补了第三代测序技术单碱基准确度略低的问题(第三代测序的测序错误是随机的，不像第二代测序具有测序偏向性，可以通过多次检测的数据进行有效纠错)，显著提高了测序准确性。优选地，所述条形码序列的长度为20～40nt，例如可以是20nt、25nt、30nt、35nt或40nt，优选为25nt。在一种实施方式中，所述方法在将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合之前，还包括对PCR扩增产物进行纯化的步骤。本专利技术中，在混合前通过对PCR扩增产物进行纯化，去除了片段较短的产物，提高了全长转录本的比例，利用第三代测序系统进行测序得到全长转录本的序列信息。优选地，所述纯化采用磁珠进行。优选地，所述磁珠与所述PCR扩增产物的体积比为(0.3～0.6):1，例如可以是0.3:1、0.4:1、0.5:1或0.6:1，优选为(0.4～0.5):1。优选地，所述纯化的次数为2～3次。根据本专利技术，使用不同比例的磁珠进行纯化可以实现对不同片段范围的扩增产物的筛选，本专利技术为筛选得到全长的扩增片段，采用的SPRI磁珠比例为样本的0.3～0.6倍体积，纯化的次数为2～3次。在另一种实施方式中，所述方法在将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合之前，还包括对逆转录体系进行核酸外切酶消化的步骤。本专利技术中，在将不同来源的cDNA混合前，为去除逆转录体系中过量的逆转录引物，采用核酸外切酶在35～40℃条件下消化5～15min，避免了过量的逆转录引物中的条形码序列对结果造成的干扰。第二方面，本专利技术提供了一种单细胞转录组测序方法，所述方法采用第一方面所述的方法处理单细胞转录组，并对产物进行第三代测序。优选地，所述第三代测序包括单分子即时DNA测序(SMRT)、Heliscope单分子测序、基于荧光共振能量转移的即时DNA测序、纳米孔单分子测序或离子流半导体测序中的任意一种，优选为纳米孔单分子测序。本专利技术中，利用逆转录引物中的条形码序列标记不同单细胞来源的cDNA，进行PCR扩增后将不同来源的PCR扩增产物混合，或将不同来源的cDNA直接混合后进行PCR扩增，满足了第三代测序系统对cDNA起始量的要求，实现了高精度检测单细胞的全长转录本的效果，最后利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞转录组的处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；/n(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；/n或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种单细胞转录组的处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；
(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；
或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和polydT。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述条形码序列与第三代测序系统兼容；
优选地，所述条形码序列的长度为20～40nt。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合之前，还包括对PCR扩增产物进行纯化的步骤。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合之前，还包括对逆转录体系进行核酸外切酶消化的步骤。


6.根据权利要求4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：范小英，苏丹，
申请(专利权)人：广州再生医学与健康广东省实验室，
类型：发明
国别省市：广东;44