生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法及其应用，本发明专利技术通过基因工程的手段，对现有蛋白生产细胞株进行改造，使其对偶联药物毒性耐受，可直接生产蛋白药物偶联物，使其由稳定共价键链接，避免蛋白药物偶联物的不稳定性产生的副作用，因此本发明专利技术在蛋白药物偶联物的研发与生产中的具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及细胞株的构建、蛋白药物偶联物的生产、抗体药物偶联物的生产。技术背景蛋白药物偶联物(protein-drugconjugate,PDC)是通过一个化学链接将具有生物活性的分子药物连接到蛋白上，目前主要包括抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)。其蛋白或单抗部分作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，而药物则在细胞中产生活性作用，例如杀死目标细胞等。但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的蛋白偶联药物在血液不稳定，容易导致致死性毒性等副作用的产生。
技术实现思路
本专利技术旨在通过基因工程的手段，对现有蛋白生产细胞株进行改造，使其对偶联药物毒性耐受，并直接生产蛋白药物偶联物，使其由稳定共价键链接，避免蛋白药物偶联物的不稳定性产生的副作用。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.构建重组蛋白生产载体，所述载体包括Cas9和靶向Dph1-7中任一种Dph的gRNA序列；所述Dph基因为人体与白喉酰胺合成相关的基因，Dph1-7高度保守，其中Dph7的在NCBI上的基因ID为GeneID:92715。S2.将上述生产载体转染入细胞进行药物毒性耐受生产细胞株的构建；S3.对构建完成的药物毒性耐受生产细胞株进行检测。本方案的原理为，真核细胞内的蛋白翻译机制依靠延伸因子2型(elongationfactor2，EF-2)，EF-2的功能核心区域包含一个修饰后的氨基酸：白喉酰胺(diphthamide)。白喉毒素(diphtheriatoxin)通过修饰白喉酰胺的方式使得EF-2丧失功能，阻断蛋白翻译过程，并诱导细胞发生凋亡。白喉酰胺生产的过程需要dph1-7的参与，将dph7敲除后，白喉酰胺修饰过程被打断，白喉毒素的细胞毒性也被清除，白喉酰胺修饰过程打断之后，不影响EF2功能发挥。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述重组蛋白生产载体上还包含GFP序列。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述重组蛋白生产载体为pX260a-GFP-Dph7，其序列如SEQIDNO.3所示。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述重组蛋白生产载体pX260a-GFP-Dph7的构建方法包括如下步骤：(1)利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物组合形成Dph7的靶向gRNA；(2)将合成Dph7靶向gRNA利用酶切位点BbsI克隆至载体pX260a-GFP，得到基因改造载体pX260a-GFP-Dph7，如SEQIDNO.3所示。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述步骤S2中药物毒性耐受生产细胞株的构建，具体包括以下步骤：(1)培养细胞；(2)取步骤S1中获的生产载体转染至细胞中；(3)对转染后的细胞进行筛选。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述所述细胞为原核或者真核细胞，包括但不限于FreeStyle293-F。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述步骤S3对构建完成的药物毒性耐受生产细胞株进行检测的具体步骤为：(1)构建检测载体，该检测载体含有白喉毒素DTA,与显示感染效率的GFP；(2)转染药物毒性耐受生产细胞株；(3)使用流式细胞仪检测GFP表达，即DTA表达情况。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，所述检测载体为pMyc-DTA-IRES-GFP，其序列如SEQID.10所示。进一步的，上述生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法在蛋白药物偶联物的研发与生产中的应用。综合上述方案，本专利技术提供了生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法及其应用，至少有以下方面的有益效果：本专利技术通过基因工程的手段，对现有蛋白生产细胞株进行改造，一方面使其对于所生产的蛋白药物偶联物具有耐受性，生产效率提高；另一方面所述细胞株生产的蛋白偶连药物由共价键稳固连接，稳定性好，在动物或者人体内使用时，在体液或者血液中不会过早的释放药物，引起不必要的副作用，因此本专利技术在蛋白药物偶联物的研发与生产中的具有良好的应用前景；进一步的，本专利技术还公开了药物毒性耐受生产细胞株的培养和鉴定方法。附图说明图1：本专利技术构建基因改造载体质粒的流程示意图；图2：pX260a-GFP空载体的质粒结构示意图；图3：基因改造载体pX260a-GFP-Dph7的质粒结构示意图；图4：pMyc-IRES-GFP空质粒示意图；图5：pMyc-DTA-IRES-GFP示意图；图6：TR细胞株鉴定结果图:图7：TR细胞株检测结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例1构建基因工程改造载体pX260a-GFP-Dph7:整体流程如附图1所示。设计正向引物Dph7-gRNA-F-TGTTGATGCTTCTCTTTCTCCA(SEQIDNO.1)，反向引物Dph7-gRNA-R-TCTGAACCAGTGTCCAGCAC(SEQIDNO.2)，退火结合为Dph7gRNA。Annealing反应体系如下：Annealing反应条件如下：将Dph7gRNA克隆至空载体pX260a-GFP(载体结构如附图2所示)：空载体pX260a-GFPBbsI(NEB)酶切。酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrepDNAGelExtractionKit(Axygen)回收。利用T4DNAligase(NEB)将载体与Dph7连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示Dph7gRNA插入成功并命名为基因改造载体pX260a-GPF-Dph7(SEQIDNO.3)，如附图2所示。实施例2药物毒性耐受生产细胞株(Toxinresistant,TR)的构建方法如下：(1)将FreeStyle293-F细胞用FreeStyleTM293培养基调整至106cells/mL，共1mL，于6孔板中培养；(2)取实施例1中获得pX260a-GFP-Dph7基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.构建重组蛋白生产载体，所述载体包括Cas9和靶向Dph1-7中任一种Dph的gRNA序列；/nS2.将上述生产载体转染入细胞进行药物毒性耐受生产细胞株的构建；/nS3.对构建完成的药物毒性耐受生产细胞株进行检测。/n

【技术特征摘要】
1.生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建重组蛋白生产载体，所述载体包括Cas9和靶向Dph1-7中任一种Dph的gRNA序列；
S2.将上述生产载体转染入细胞进行药物毒性耐受生产细胞株的构建；
S3.对构建完成的药物毒性耐受生产细胞株进行检测。


2.根据权利要求1所述的生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，其特征在于，所述重组蛋白生产载体上还包含GFP序列。


3.根据权利要求1所述的生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，其特征在于，所述重组蛋白生产载体为pX260a-GFP-Dph7，其序列如SEQIDNO.3所示。


4.根据权利要求3所述的生产蛋白药物偶联物的药物毒性耐受生产细胞株的构建方法，其特征在于，所述重组蛋白生产载体pX260a-GFP-Dph7的构建方法包括如下步骤：
(1)利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物组合形成Dph7的靶向gRNA；
(2)将合成Dph7靶向gRNA利用酶切位点BbsI克隆至载体pX260a-GFP，得到基因改造载体pX260a-GFP-Dph7，如SEQIDNO.3所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，
申请(专利权)人：乾元康安苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32