家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法技术方案

本发明专利技术涉及家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法，包含用于递送CRISPR/Cas9系统的递送载体系统piggyBac转座子载体系统和家蚕全部编码蛋白的基因的打靶位点的sgRNA序列共同组成的载体文库pB‑CRISPR‑library。本发明专利技术基于piggyBac转座子系统的强大的承载容量，可以将CRISPR/Cas9系统的两个组成原件Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框整合到一个载体上，同时该载体还包含筛选标记Zeocin抗性基因表达框，共同组成了一个用于家蚕的CRISPR/Cas9敲除的all‑in‑one载体pB‑CRISPR。

【技术实现步骤摘要】
家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法
本专利技术属于真核生物基因敲除
，涉及家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法。
技术介绍
家蚕不仅是重要的经济昆虫，也是鳞翅目模式生物。家蚕是最早完成全基因组测序的生物之一，家蚕基因组计划完成后，家蚕功能基因组研究就成为了家蚕研究领域的重要方向，目前已经建立了转基因、RNAi、基因编辑等遗传操作技术用于研究家蚕功能基因，但是，面对数以万计的家蚕编码蛋白基因的功能，传统的正向遗传学耗时耗力，迫切需要一种高通量研究手段来研究数量巨大的家蚕功能基因。高通量RNAi是最早用于研究真核生物功能基因的高通量研究方法(PMID:25145850)，已经在人、鼠等物种取得了很多研究成果，但是RNAi天然存在的脱靶效应、无法完全敲除基因功能而只能敲低功能基因的mRNA表达水平等缺点，其高通量筛选研究受到限制。CRISPR/Cas9系统是近年来开发出来的基因敲除技术，已经在包括人、鼠、果蝇、拟南芥、水稻等模式生物钟取得了显著成果，目前CRISPR/Cas9系统在家蚕中的应用也已经取得了成功。CRISPR/Cas9系统是由两部分元件组成，用于执行核酸内切酶功能的Cas9蛋白和用于执行引导Cas9蛋白到打靶位点的功能的sgRNA。基于其设计和构建的简便性，CRISPR/Cas9系统不仅能够实现单个基因的敲除，还可以非常方便地设计并构建用于全基因组敲除的sgRNA文库，从而实现全基因组编辑，目前，在真核生物中主要是运用慢病毒载体系统来递送CRISPR/Cas9全基因组敲除文库。但是，慢病毒系统有着固有的缺点，一、慢病毒载体承载容量有限，一般只能够携带几kbp的外源基因，而且随着插入片段长度增加病毒滴度急剧降低，因此，慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因敲除系统一般是先将Cas9表达框整合到宿主细胞的基因组上，然后再将sgRNA表达框整合到宿主细胞的基因组上，增加了构建CRISPR/Cas9基因敲除文库的周期、成本和难度；二、无法广泛应用于多种类型真核生物，主要应用在哺乳动物，慢病毒系统无法在昆虫等物种中递送CRISPR/Cas9敲除文库。piggyBac转座子是最初发现于鳞翅目昆虫，是真核生物的第二类转座子，以“剪切-黏贴”的模式来实现转座。piggyBac系统的宿主范围广泛，从低昆虫哺乳动物均可实现高效转座，piggyBac转座子可以携带的外源基因片段极大，可达207kb。应用piggyBac系统可以将Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框构建到同一个piggyBac转座载体上，只需要一步转染就可以CRISPR系统整合到宿主细胞的基因组上，极大缩短实验周期，降低实验成本和操作难度。由于piggyBac转座子是以“剪切-黏贴”的方式来实现来实现转座，因此可以通过控制转座子浓度等方式来控制piggyBac转座子系统携带的外源基因整合到宿主细胞的拷贝数。在家蚕中还没有任何高通量研究功能基因组的技术手段，构建家蚕基于piggyBac系统和CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除的载体文库非常必要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库及构建方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库的构建方法，具体步骤如下：(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，将其作为骨架载体；(2)设计敲除家蚕全部基因的sgRNA，其核苷酸序列是位于基因区符合NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG特征的序列；(3)将步骤(2)的sgRNA整合到步骤(1)的骨架载体上，构建得到所述载体文库。作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，载体pB-CRISPR包括Hr3CQEnhancer-Hsp70启动子启动的spCas9蛋白编码序列，IE2启动子启动的Zeocin抗性蛋白编码序列，U6启动子启动的sgRNA表达框和piggyBac转座子的转座臂。作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：(1-1)合成包含Zeocin抗性基因表达框的载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA；(1-2)将载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA上的Zeocin抗性基因表达框IE2-Zeocin-Ser1PA表达框连接到piggyBac转座子基础载体piggyBacModify上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}；(1-3)将hr3-hsp70-Cas9-sv40表达框从载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40上扩增出来，然后用无缝克隆的方法连接到pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}；(1-4)将U6-gRNA从载体pUC57-U6-gRNA扩增出来，用酶切连接的方法连接到载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}的AscI/NheI位点，构建成真核生物基因敲除基础载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{U6-gRNA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，命名为pB-CRISPR；其中，载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；piggyBac转座子基础载体piggyBacModify，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40，核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；载体PUC57-Hr3-Hsp70-Cas9-SV40，由pUC57-hA4-Cas9(PMID:24671069，核苷酸序列如SEQIDNO.6所示)将启动子A4更换为Hsp70得到；中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}，核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；载体pUC57-U6-gRNA，核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。载体图谱如图1所示。作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，pB-CRISPR包含家蚕U6启动子和sgRNA的骨架，它们的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。作为进一步优选的技术方案之一，基于家蚕U6启动子在第一个核苷酸为鸟嘌呤核苷酸“G”时的启动效率最高，全部sgRNA序列的5’端添本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其作为骨架载体；/n(2)设计敲除家蚕全部基因的sgRNA，其核苷酸序列是位于基因区符合NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG特征的序列；/n(3)将步骤(2)的sgRNA整合到步骤(1)的骨架载体上，构建得到所述载体文库。/n

【技术特征摘要】
1.家蚕基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除载体文库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pB-CRISPR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，将其作为骨架载体；
(2)设计敲除家蚕全部基因的sgRNA，其核苷酸序列是位于基因区符合NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG特征的序列；
(3)将步骤(2)的sgRNA整合到步骤(1)的骨架载体上，构建得到所述载体文库。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，载体pB-CRISPR包括Hr3CQEnhancer-Hsp70启动子启动的spCas9蛋白编码序列，IE2启动子启动的Zeocin抗性蛋白编码序列，U6启动子启动的sgRNA表达框和piggyBac转座子的转座臂。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：
(1-1)合成包含Zeocin抗性基因表达框的载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA；
(1-2)将载体PUC57-IE2-Zeocin-Ser1PA上的Zeocin抗性基因表达框IE2-Zeocin-Ser1PA表达框连接到piggyBac转座子基础载体piggyBacModify上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}；
(1-3)将hr3-hsp70-Cas9-sv40表达框从载体pUC57-hr3-hsp70-Cas9-sv40上扩增出来，然后用无缝克隆的方法连接到pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}上，构建成中间载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}；
(1-4)将U6-gRNA从载体pUC57-U6-gRNA扩增出来，用酶切连接的方法连接到载体pB-Modified{IE2-Zeocin-Ser1PA}{hr3-hsp70-Cas9-SV40}的AscI/NheI位点，构建成真核生物基因敲除基础载体pB-Modifie...

【专利技术属性】
技术研发人员：马三垣，常珈菘，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50