一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种真核生物CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库及构建方法，首先是构建一种piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除骨架载体，然后综合运用搭桥PCR和酶切连接方法构建真核生物全基因组敲除突变体文库。本发明专利技术的特点是递送系统选用具有广泛生物适用性和超大外源基因承载能力的piggyBac转座子系统，构建方法选用搭桥PCR和酶切连接方法。构建的真核生物全基因组敲除载体文库效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库及构建方法
本专利技术属于基因编辑
，涉及一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库及构建方法。
技术介绍
随着测序技术的发展，越来越多的生物完成了全基因组测序，功能基因组研究日益成为生命科学研究的重要领域。面对海量的功能基因组数据，传统的研究手段耗时耗力，显得力不从心。如何高效快速的研究功能基因组，越来越成为生命科学家们关心的问题。基因编辑技术是近年来发展起来的一种遗传操作技术，CRISPR/Cas9是基因编辑技术中效率最高，最经济的技术。除了实现单个基因的编辑，CRISRP/Cas9还可以通过设计构建简单的sgRNA文库，很方便的执行全基因组编辑。CRISPR/Cas9全基因组编辑库能够很方便的执行功能基因组筛选，目前已经在人、小鼠等物种中实现了药物靶点基因筛选、抗病毒靶点基因筛选等，是研究功能基因组的重要手段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种真核生物CRISPA/Cas全基因组编辑载体文库及构建方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种真核生物CRISPA/Cas全基因组编辑载体文库的构建方法，具体步骤如下：(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9基因敲除载体骨架，命名为pB-CRISPRv2，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)构建一个有U6启动子核苷酸序列的载体，命名为T-U6，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(3)构建一个有sgRNAscaffold核苷酸序列的载体，命名为T-sgRNAscaffold，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(4)设计全部真核生物蛋白编码基因的打靶位点，然后根据U6启动子的核苷酸序列和sgRNAscaffold的核苷酸序列，设计sgRNA的侧翼序列，合成包含侧翼区的全部sgRNA序列，命名为单链寡核苷酸库(ThepoolofsgRNAoligonucleotides)；(5)以载体T-U6为模板，扩增U6启动子片段，命名为DGP-1；以合成的ThepoolofsgRNAoligonucleotides为模板，扩增sgRNA片段，命名为DGP-2；以载体T-sgRNAscaffold为模板，扩增sgRNAscaffold片段，命名为DGP-3；然后以DGP-1、DGP-2、DGP-3的混合物为模板，进行搭桥PCR实验，扩增出包含sgRNA库的U6-sgRNA文库片段，命名为DGP-4；(6)分别将载体pB-CRISPRv2和片段DGP-4酶切后混合连接，建库，即得所述载体文库。作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，pB-CRISPRv2包含：piggyBac转座臂(包含piggyBac转座子末端反向重复序列，invertedterminalrepeat,ITR)、筛选标记Zeocin抗性基因表达框、Cas9蛋白表达框、大肠杆菌致死基因ccDB表达框。作为优选的技术方案之一，步骤(4)的具体方法是：根据spCas9作用规律，结合真核生物蛋白编码基因，设计全部真核生物蛋白编码基因的打靶位点，绝大多数蛋白的打靶位点为6个，其核苷酸具有如下规律：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，所有打靶位点都在CDS序列的前半部分，靠近PAM区的种子序列部分12bp核苷酸不能在基因组上有重复区域；设计sgRNA的侧翼序列，具有以下规律：5’-TACAAAATATCGTGCTCTACAAGTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’，其中“N”为sgRNA序列，用基因芯片的方式合成包含侧翼区的全部sgRNA序列，命名为ThepoolofsgRNAoligonucleotides，核苷酸序列如SEQIDNO.4。作为优选的技术方案之一，步骤(5)中，设计搭桥PCR引物，包括：>KU-1R，5’-TCGATGATGATGATCAATTGTGGCGCGCCAAGCTGTCCAAGGAATGCGT-3’，SEQIDNO.5；>DG-1R，5’-TTGTAGAGCACGATATTTTGTATAT-3’，SEQIDNO.6；>DP-2F，5’-TCAATAGTTTAGTTTTTTTAGGTATATATACAAAATATCGTGCTCTACAA-3’，SEQIDNO.7；>DP-2R，5’-AAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAA-3’，SEQIDNO.8；>DG-3F，5’-TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA-3’，SEQIDNO.9；>KU-1F，5’-ACCGATCGATCCTAGGCGCTAGCTAATGAAAGATCTTTATCGATTTAGC-3’，SEQIDNO.10。作为进一步优选的技术方案之一，DGP-1、DGP-2、DGP-3的合成方法如下：以载体T-U6为模板，用引物KU-1R和DG-1R来扩增U6启动子片段，命名为DGP-1；以；ThepoolofsgRNAoligonucleotides为模板，用引物DP-2F和DP-2R来扩增sgRNA片段，命名为DGP-2；以载体T-sgRNAscaffold为模板，用引物DG-3F和KU-1F来扩增sgRNAscaffold片段，命名为DGP-3。作为进一步优选的技术方案之一，以DGP-1、DGP-2、DGP-3的混合物为模板，用引物KU-1F和KU-1R来进行搭桥PCR实验，扩增出包含sgRNA库的U6-sgRNA文库片段，命名为DGP-4。作为优选的技术方案之一，步骤(5)中，DGP-1、DGP-2、DGP-3按照摩尔比1：1：1混合。作为优选的技术方案之一，步骤(6)中，载体pB-CRISPRv2和片段DGP-4均利用AscI/NheI双酶切。作为进一步优选的技术方案之一，载体pB-CRISPRv2的酶切条件为50μL体系，包含：1μg载体，AscI和NheI各1μL，双蒸水补齐50μL；回收12187bp的骨架。作为进一步优选的技术方案之一，片段DGP-4的酶切条件为50μL体系，包含：1μg片段，AscI和NheI各1μL，双蒸水补齐50μL。作为优选的技术方案之一，步骤(6)中，酶切完成的载体pB-CRISPRv2和酶切完成的片段DGP-4以摩尔比1：10混合后用DNA连接酶连接，然后通过电转方式建库，抽提质粒，完成建库，建库覆盖度大于100×。2、利用上述方法构建得到的一种真核生物CRISPA/Cas全基因组编辑载体文库。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首先是构建一种piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9敲除骨架载体，然后综合运用搭桥PCR和酶切连接方法构建真核生物全基因组敲除突本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真核生物CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9基因敲除载体骨架，命名为pB-CRISPRv2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；/n(2)构建一个有U6启动子核苷酸序列的载体，命名为T-U6，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；/n(3)构建一个有sgRNA scaffold核苷酸序列的载体，命名为T-sgRNA scaffold，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；/n(4)设计全部真核生物蛋白编码基因的打靶位点，然后根据U6启动子的核苷酸序列和sgRNA scaffold的核苷酸序列，设计sgRNA的侧翼序列，合成包含侧翼区的全部sgRNA序列，命名为单链寡核苷酸库；/n(5)以载体T-U6为模板，扩增U6启动子片段，命名为DGP-1；以合成的The pool ofsgRNA oligonucleotides为模板，扩增sgRNA片段，命名为DGP-2；以载体T-sgRNA scaffold为模板，扩增sgRNA scaffold片段，命名为DGP-3；然后以DGP-1、DGP-2、DGP-3的混合物为模板，进行搭桥PCR实验，扩增出包含sgRNA库的U6-sgRNA文库片段，命名为DGP-4；/n(6)分别将载体pB-CRISPRv2和片段DGP-4酶切后混合连接，建库，即得所述载体文库。/n...

【技术特征摘要】
1.一种真核生物CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建piggyBac转座子系统介导的真核生物CRISPR/Cas9基因敲除载体骨架，命名为pB-CRISPRv2，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)构建一个有U6启动子核苷酸序列的载体，命名为T-U6，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
(3)构建一个有sgRNAscaffold核苷酸序列的载体，命名为T-sgRNAscaffold，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(4)设计全部真核生物蛋白编码基因的打靶位点，然后根据U6启动子的核苷酸序列和sgRNAscaffold的核苷酸序列，设计sgRNA的侧翼序列，合成包含侧翼区的全部sgRNA序列，命名为单链寡核苷酸库；
(5)以载体T-U6为模板，扩增U6启动子片段，命名为DGP-1；以合成的ThepoolofsgRNAoligonucleotides为模板，扩增sgRNA片段，命名为DGP-2；以载体T-sgRNAscaffold为模板，扩增sgRNAscaffold片段，命名为DGP-3；然后以DGP-1、DGP-2、DGP-3的混合物为模板，进行搭桥PCR实验，扩增出包含sgRNA库的U6-sgRNA文库片段，命名为DGP-4；
(6)分别将载体pB-CRISPRv2和片段DGP-4酶切后混合连接，建库，即得所述载体文库。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，pB-CRISPRv2包含：piggyBac转座臂、筛选标记Zeocin抗性基因表达框、Cas9蛋白表达框、大肠杆菌致死基因ccDB表达框。


3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)的具体方法是：根据spCas9作用规律，结合真核生物蛋白编码基因，设计全部真核生物蛋白编码基因的打靶位点，绝大多数蛋白的打靶位点为6个，其核苷酸具有如下规律：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，所有打靶位点都在CDS序列的前半部分，靠近PAM区的种子序列部分12bp核苷酸不能在基因组上有重复区域；设计sgRNA的侧翼序列，具有以下规律：5’-TACAAAATATCGTGCTCTACAAGTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’，其中“N”为sgRNA序列，用基因芯片的方式合成包含侧翼区的全部sgRNA序列，命名为单链寡核苷酸库，核苷酸序列如SEQIDNO.4。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：马三垣，常珈菘，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50