靶向TRBC1 CAR-T细胞的制备方法与应用技术

本发明专利技术提供靶向TRBC1 CAR‑T细胞的制备方法与应用。本发明专利技术还提供编码TRBC1 CAR的基因和包含所述基因的生物材料以及TRBC1 CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1 CAR‑T的方法。T细胞包含TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）细胞，因此TRBC1 CAR感染T细胞，不仅导入C2（CAR‑C2），而且会导入C1（CAR‑C1），CAR‑C1的CAR与自身TRBC1结合从而导致TRBC1不被其他TRBC1 CAR‑T识别，而且导致CAR‑C1杀伤能力下降。因此制备TRBC1 CAR‑T时，需预先去除TRBC1阳性T细胞。

【技术实现步骤摘要】
靶向TRBC1CAR-T细胞的制备方法与应用
本专利技术涉及免疫治疗领域，具体地说，涉及一种靶向TRBC1CAR-T细胞的制备方法与应用。
技术介绍
T细胞白血病和淋巴瘤侵袭性较强，且缺乏有效靶向治疗手段，5年生存率较低。因此，亟需探索治疗T细胞白血病和淋巴瘤的新方法。嵌合抗原受体（Chimericantigenreceptor，CAR）基因修饰T细胞（CAR-T）疗法通过基因工程技术将识别肿瘤细胞且能激活T细胞的CAR体外导入患者外周血T细胞，赋予T细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，再将改造过的T细胞回输给患者，从而达到控制甚至清除肿瘤的一种免疫治疗技术。虽然CAR-T疗法在B细胞白血病和淋巴瘤治疗中取得显著疗效，然而正常T细胞、肿瘤T细胞和治疗性T细胞的相似性限制了CAR-T免疫疗法在T细胞恶性肿瘤中的应用。T细胞受体（Tcellreceptor，TCR）是T细胞特异且广泛表达的一种膜蛋白，包括正常和恶性T细胞，因此TCR可以作为T细胞肿瘤的CAR-T识别靶点。TCR由α和β链组成，二者均分别包含可变区和恒定区，其中TCRβ链恒定区的编码基因为TRBC1或TRBC2，即每个T细胞TCRβ链恒定区随机表达TRBC1或TRBC2，因此人体正常T细胞由表达TRBC1和TRBC2的T细胞亚群组成（图1）。由于T细胞随机表达TRBC1或TRBC2，因此每类功能T细胞中表达TRBC1和TRBC2的比例相对稳定（TRBC1:TRBC2约1:2），例如CD4阳性和CD8阳性T细胞中表达TRBC1和TRBC2的比例相近，因此全部删失TRBC1阳性T细胞或TRBC2阳性T细胞都会保留部分功能T细胞而不会对免疫系统造成严重破坏。然而，T细胞来源的肿瘤细胞是单克隆起源，仅表达TRBC1或TRBC2，因此靶向识别TRBC1或TRBC2的CAR-T细胞，预期不仅可以消除T细胞来源的肿瘤细胞而且还可以保留部分正常T细胞。因此，TRBC1和TRBC2分子是T细胞恶性肿瘤潜在的CAR-T治疗靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向TRBC1CAR-T细胞的制备方法与应用。本专利技术的另一目的是提供编码TRBC1CAR的基因和包含该基因的生物材料以及TRBC1CAR感染T细胞前需删除TRBC1阳性T细胞从而构建TRBC1CAR-T的方法。。本专利技术构思如下：JOVI-1抗体可以特异识别TRBC1，其轻链可变区和重链可变区用于构建TRBC1CAR慢病毒载体，并将其感染患者外周血T细胞（TRBC1CAR-T）可以靶向识别和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，但由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细胞，因此TRBC1CAR慢病毒感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避免地导入C1细胞（CAR-C1），研究人员发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其他TRBC1CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有TRBC1阳性T细胞会加速TRBC1CAR-T细胞的衰竭和终末分化。TRBC1CAR-T细胞可以特异识别和杀伤TRBC1阳性肿瘤细胞，可作为TRBC1阳性T细胞恶性肿瘤患者潜在有效的治疗方法，但制备TRBC1CAR-T细胞前必须预先去除其中TRBC1阳性T细胞。本专利技术为TRBC1阳性T细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞治疗提供有力工具。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码蛋白的氨基酸如SEQIDNO:2所示。本专利技术中，CAR的设计包含CD8α信号肽，anti-TRBC1轻链可变区，连接接头，anti-TRBC1重链可变区，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，4-1BB，CD3ζ胞内信号区和FLAG-tag，并进行全基因合成，CAR的结构示意图见图3。将合成的基因通过EcoRI与SalI双酶切，克隆到慢病毒载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato中，并命名为pCDH-EF1-TRBC1CAR。第二方面，本专利技术提供含有所述CAR基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体（如慢病毒或逆转录病毒）、工程菌或转基因细胞系。第三方面，本专利技术提供一种靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体，所述慢病毒载体携带有所述CAR基因。所述慢病毒载体的出发载体可以是pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato。第四方面，本专利技术提供靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体的制备方法，包括：将所述CAR基因构建到载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato的XbaI和SalI酶切位点之间。第五方面，本专利技术提供所述CAR基因、含有所述CAR基因的生物材料、携带有CAR基因的慢病毒载体，或按照上述方法制备的慢病毒载体在制备靶向TRBC1的CAR-T细胞中的应用。第六方面，本专利技术提供靶向TRBC1的CAR-T细胞的制备方法，包括：将所述CAR基因通过慢病毒载体导入TRBC2阳性T细胞中，使CAR基因整合到T细胞基因组上，从而实现目的基因在TRBC2阳性T细胞中的表达。具体如下：1）按照前述方法制备慢病毒载体，用携带有CAR基因的慢病毒载体转染宿主细胞（如293ft细胞），产生慢病毒；2）利用流式细胞仪或磁珠从外周血中分离出TRBC2阳性T细胞，并用慢病毒感染TRBC2阳性T细胞。TRBC2阳性T细胞的获得方法包括：向外周血T细胞中加入JOVI-1抗体，通过流式细胞仪或磁珠去除TRBC1阳性T细胞（TRBC1+T细胞，记为C1），从而获得TRBC2阳性T细胞（TRBC2+T细胞，记为C2）。第七方面，本专利技术提供按照上述方法制备的靶向TRBC1的CAR-T细胞。第八方面，本专利技术提供所述CAR-T细胞的以下任一应用：i）用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病；ii）用于制备治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物。第九方面，本专利技术提供用于治疗T细胞淋巴瘤和T细胞白血病的药物或组合物，有效成分为所述CAR-T细胞。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：由于外周血T细胞中存在TRBC1阳性（C1）和阴性（C2）两群T细胞，因此TRBC1CAR慢病毒感染外周血T细胞时，不仅会导入C2细胞（CAR-C2），而且会不可避免地导入C1细胞（CAR-C1），本专利技术首次发现：（1）CAR-C1细胞中的CAR与自身的TRBC1结合从而导致TRBC1不能被其他TRBC1CAR-T细胞识别；（2）大量CAR被自身TRBC1结合而不能识别靶细胞的TRBC1从而导致CAR-C1细胞识别和杀伤靶细胞的能力下降；（3）CAR-C2细胞中混有TRBC1阳性T细胞会加速TRBC1CAR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.靶向T细胞TRBC1的CAR基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.含有权利要求1所述CAR基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。


3.靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体携带有权利要求1所述CAR基因；
优选地，出发载体为pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato。


4.靶向TRBC1阳性T细胞的慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述CAR基因构建到载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato的XbaI和SalI酶切位点之间。


5.权利要求1所述CAR基因、权利要求2所述生物材料、权利要求3所述慢病毒载体，或按照权利要求4所述方法制备的慢病毒载体在制备靶向TRBC1的CAR-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆哲明，张超亭，申潞艳，
申请(专利权)人：北京市肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11