一种用于核酸扩增及检测的装置和检测方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种用于核酸扩增及检测的装置及加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法能够在核酸扩增反应后引入CRISPR系统检测试剂，但不会产生扩增物气溶胶污染的，并且该装置可用于后续可视化检测。该装置包括管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件、密封承载薄膜、穿刺物；管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸扩增及检测的装置和检测方法
本专利技术属于核酸扩增和检测的领域，其具体内容涉及到一种用于核酸扩增及检测的装置和检测方法。
技术介绍
由于核酸分子具有较强的稳定性、特异性等优点，许多研究者将核酸作为目标物来对转基因作物及制品、肉类及制品、微生物、病毒等进行检测。在核酸检测过程中，往往需要对核酸先进行扩增，使其达到可检测的数量范围。核酸扩增技术根据扩增过程是否需要变温，分为变温扩增与恒温扩增两大类。变温扩增最常见的就是三温区PCR(聚合酶链式反应)反应技术。该技术是目前应用最为广泛的核酸扩增技术，其主要分为三部分：高温变性、低温退火和中温延伸。也有许多科研人员研究二温区的PCR反应，将退火与延伸安排在一个温度条件下进行，也可实现核酸扩增。但不管怎样，PCR反应技术都需要高温，对设备及装置要求较高。为此，以LAMP(环介导等温扩增)、RPA(重组酶聚合酶等温扩增)等为代表的核酸恒温扩增技术越来越受到人们的喜爱。由于核酸扩增技术将核酸分子实现了百万倍扩增，不可避免的会产生一定的气溶胶污染，对实验结果产生干扰。另外，这些核酸扩增技术的特异性并不是特别高，有时候在实验过程中会出现一些非特异性扩增，造成假阳性，干扰实验结果。在核酸可视化检测过程中，常见的是利用荧光嵌入染料(EthidiumBromide、SYBRGreen、SYTO9、EvaGreen等)与核酸结合产生特定波长荧光，从而对核酸扩增产物进行检测。由于这些染料结合具有非特异性，因此当核酸扩增过程中产生非异性扩增产物时，这些荧光嵌入染料也能与非特异性扩增产物结合产生特定波长荧光，从而干扰实验结果。CRISPR-Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-CRISPRassociated)系统是一种广泛存在原核生物中的，由RNA介导的获得性免疫系统，主要用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒、质粒等。由于CRISPR-Cas系统能够对核酸片段进行特异识别并进行切割，常被研究人员用来进行基因编辑。随着typeV酶功能的发现，人们开始尝试将CRISPR-Cas系统用于核酸特异性检测。typeV酶能够在guideRNA的辅助下识别目的核酸并进行切割，在切割目的核酸的过程中还能对非特异性单链DNA进行切割。目前，已有一些研究人员将CRISPR-Cas系统与RPA核酸扩增技术结合进行核酸特异性检测。由于绝大多数CRISPR-Cas系统的酶工作温度在37℃，在高温下这些酶将或迅速失活，因此很难将其应用在PCR、LAMP等需要超过60℃才能进行的核酸扩增反应中。如果在反应后引入CRISPR-Cas系统，需要开盖，往往会产生扩增物气溶胶污染，干扰实验结果。针对这些问题，本专利技术提出了一种基于核酸扩增及检测的反应装置。
技术实现思路
本专利技术首先所要解决的技术问题是提供一种能够在核酸扩增反应后引入CRISPR系统检测试剂，但不会产生扩增物气溶胶污染的用于核酸扩增及检测的装置，并且该装置可用于后续可视化检测。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种用于核酸扩增及检测的装置，包括管体，其特征在于所述装置还包括第一层过流密封元件、第二层密封元件、密封承载薄膜、穿刺物；管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。所述反应容器的管体、第一层过流密封元件和第二层密封元件可以均为一体成型的或者由独立组件组装成型。管体的材质为玻璃或者塑料等高分子材料，其为透明材质，或其它适用于可视化检测的能辨认内部颜色的材质。第一层过流密封元件、第二层密封元件和尖锐状穿刺物的材质为玻璃、塑料或者金属等，可以为透明材质，也可以为不透明材质。进一步地，所述密封承载薄膜设置在第一层过流密封元件上，将所述上部接口和下部接口隔开，或设置在第一层过流密封元件的下部接口处。进一步地，第一层过流密封元件的中部具有台阶，所述密封承载薄膜设置在台阶上。进一步地，所述第二层密封元件为核酸扩增后的检测工作时的密封盖，所述穿刺物设置在所述盖的内侧顶面上。进一步地，所述穿刺物的长度满足在第二层密封件和所述第一层过流密封元件基本密封连接时，穿刺物再穿破所述密封承载薄膜。进一步地，所述反应容器的管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件三者之间可通过螺纹但不限于螺纹进行连接。所述反应容器的管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件之间的连接需保证密封性。本专利技术还提供一种加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法，能够在核酸扩增反应后引入CRISPR系统检测试剂，但不会产生扩增物气溶胶污染，可用于后续可视化检测。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)在管体中加入核酸扩增反应体系及模板；(2)将密封承载薄膜及能够和盖连接的结构连接在管体上，并将管体封闭，(3)待核酸扩增反应结束后，在密封承载薄膜上加CRISPR系统的检测试剂；然后盖上带有能穿破密封承载薄膜的穿刺物的盖，在所述盖与所述能和盖连接的结构连接时，穿刺物穿破密封承载薄膜，转由所述盖进行封闭；(4)将检测试剂和管体中的核酸反应扩增子混合及反应，进行可视化检测。本专利技术的上述装置能够应用上述检测方法，将核酸扩增反应液与模板置于管体中，将第一层过流密封元件连接在管体上，或者将密封承载薄膜放置在管体上，用第一层过流密封元件连接在管体上时将密封承载薄膜固定住，可将扩增反应液与外界环境完全隔离；然后将管体置于相应的核酸扩增条件下进行核酸扩增。扩增结束后，待管体的温度降至CRISPR系统的酶可工作的温度时，将CRISPR系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜上，这时密封承载薄膜和第一层过流密封元件的组合起到两个作用，第一是隔绝核酸扩增液和外界环境，起到密闭作用；第二是作为一个容器，容纳CRISPR系统的检测试剂；之后，将第二层密封元件与第一层过流密封元件连接，在第二层密封元件已与第一层过流密封元件进行了一定的连接时，穿刺物刺破密封承载薄膜。最后将CRISPR系统的检测试剂引入到核酸扩增反应液中反应，进行后续检测。本专利技术的上述装置和检测方法可以适用于各种CRISPR系统检测试剂进行核酸检测，操作简单，并能防止扩增物气溶胶污染。在上述装置的基础上，本专利技术还提供了一种可用于特异可视化检测核酸扩增产物的CRISPR-Cas系统的检测试剂。所述的CRISPR-Cas系统的检测试剂包含Cas蛋白、缓冲液、引导RNA序列(gRNA)、单链DNA荧光探针、RNA酶抑制剂、无菌水等。所述检测试剂中，Cas蛋白的工作浓度范围为0.1μM至1.5μM；引导RNA序列(gRNA)的工本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于核酸扩增及检测的装置，包括管体(1)，其特征在于所述装置还包括第一层过流密封元件(2)、第二层密封元件(3)、密封承载薄膜(2a)、穿刺物(3a)；/n管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；/n第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；/n第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸扩增及检测的装置，包括管体(1)，其特征在于所述装置还包括第一层过流密封元件(2)、第二层密封元件(3)、密封承载薄膜(2a)、穿刺物(3a)；
管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；
第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；
第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。


2.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增及检测的装置，其特征在于所述密封承载薄膜设置在第一层过流密封元件上，将所述上部接口和下部接口隔开，或设置在第一层过流密封元件的下部接口处。


3.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增及检测的装置，其特征在于第一层过流密封元件的中部具有台阶，所述密封承载薄膜设置在台阶上。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，伍辉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33