用于治疗弗里德希氏共济失调的载体制造技术

本发明专利技术提供用于治疗弗里德希氏共济失调的基因疗法。具体地，本发明专利技术提供用于生产腺相关病毒(AAV)载体的核酸、克隆载体和转移载体。所述核酸包含(i)编码共济蛋白的核酸序列，(ii)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。本发明专利技术还提供包含所述AAV载体或核酸的药物组合物。此外，所述AAV载体、核酸或药物组合物可用作药物，具体地作为用于治疗弗里德希氏共济失调的药物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗弗里德希氏共济失调的载体
本专利技术可被包括在用于治疗弗里德希氏共济失调(Friedreich'sataxia)的新疗法的领域中。具体地，本申请涉及用于基因疗法的新产品。所述产品能够治疗弗里德希氏共济失调。
技术介绍
弗里德希氏共济失调(FRDA；OMIM#229300)是一种罕见的遗传性神经退行性疾病，其引起神经系统的进行性损伤，导致范围从步态障碍和语言问题到心脏疾病或心肌病的症状。这种疾病以在19世纪60年代第一个对其进行描述的医生尼古拉斯-弗里德希(NikolausFriedreich)命名。共济失调，涉及运动协调问题，如笨拙的动作和不稳定，由于脊髓和控制手臂和腿部的肌肉运动的神经中的神经组织变性而出现在弗里德希氏共济失调中。脊髓萎缩同时神经细胞失去其部分髓鞘。弗里德希氏共济失调虽然不常见，但却是最常见的遗传性共济失调，每3万-5万活产儿中就有1例，发病率为2-4/10万。两种性别受到相同影响。症状通常在年龄为5-15岁之间开始出现，但在极少数情况下，最早可在18个月或晚至年龄为50岁时出现。出现的第一个症状通常是行走困难，即步态共济失调。共济失调逐渐恶化，并慢慢扩散到手臂，然后到躯干。脚部畸形，如弓形足，脚趾无意识折叠，或锤状趾都可能作为早期症状出现。随着时间的推移，肌肉开始衰弱和被消耗，尤其是在足部、腿部和手部，并且出现畸形。其他症状包括肌腱反射丧失，尤其是在膝关和脚踝。通常，四肢感觉逐渐丧失，这可扩散到身体的其他部位。出现构音障碍，并且患者容易感到疲劳。被称为眼球震颤的眼球的快速、有节奏且不自主的运动是常见的。大多数弗里德希氏共济失调患者出现脊柱侧弯，如果严重的话，这会影响呼吸。可能发生的其他症状有胸痛、呼吸短促和心悸。这些症状是常伴随弗里德希氏共济失调的多种形式的心脏疾病(如肥厚性心肌病，心肌纤维化，或心力衰竭)的结果。心率异常如心动过速和心阻也是常见的。约20％的弗里德希氏共济失调患者发展出碳水化合物不耐受并且30％显示糖尿病。一些受影响的人丧失听力或视力。疾病进展速度因人而异。通常，在最初症状发作后的10至20年间，人被困于轮椅中，并且在该疾病的后期，个体变得完全残疾。预期寿命可能会受影响。许多弗里德希氏共济失调患者在成年期死于相关的心脏疾病，其是最常见的死因。然而，一些有较不严重弗里德希氏共济失调症状的人有时可存活60或70年。神经成像(如MRI)尽管渐渐揭示颈椎脊髓和小脑的可变性萎缩，但在该病的早期显示正常的外观。这通常显示上脚(superiorpeduncle)萎缩。电生理学研究显示在感觉动作电位不存在或减小的情况下大于40m/s的传导速度，以及H反射的缺失。在神经病理学水平，观察到脊髓、后根以及偶尔的小脑的显著萎缩以及心脏肥大。在外周感觉神经中鉴定出神经变性，以及大背根神经节感觉神经元的逐渐丧失，脊柱变性，克拉克氏脊柱和脊髓小脑纤维、锥体束中的神经元的跨突触变性，以及薄束核和楔形核的萎缩。继发性损伤可以包括影响大的谷氨酸能神经元的小脑中的齿状核的萎缩，以及贝茨细胞和皮层脊髓束的萎缩。在1996年，弗里德希氏共济失调的病因被确定为位于9号染色体(9q21区)的FXN基因的分子缺陷。所述突变由位于FXN基因的第一个内含子中的ALU序列内的GAA三联体的异常纯合子扩张(expansion)组成。约98％的FRDA患者的2个染色体中各自具有的GAA重复的数目为201至1,700(更常见地，600至900)。然而，2％-5％的FRDA患者呈现GAA扩张和复合杂合中的FXN基因中的点突变(表1)。迄今，已经描述了超过17种不同的FXN基因突变能够触发FRDA。FRDA中的GAA扩张在减数分裂期间是非常不稳定的并且干扰FXN基因转录，引起异常低水平的共济蛋白mRNA。GAA扩张将使FXN基因的转录沉默并且因此通过形成三链DNA结构或DNA-RNA杂交体或两者而破坏共济蛋白表达。最近，有人提出GAA扩张会由于在GAA过度扩张附近形成异染色质样结构而阻断转录的自起始到延伸的过渡。还有人提出GAA扩张会导致位于FXN基因的5’上游区域中的CpG位点的表观遗传甲基化，从而导致其沉默。因此，作为FXN基因中的GAA突变的结果，在FRDA中出现共济蛋白的缺乏。表1.引起弗里德希氏共济失调的FXN基因中确定的最常见的等位变体.FXN基因编码小的保守的线粒体蛋白质，所述蛋白质在其前体形式中含有210个氨基酸(aa)，具有23,135Da的分子量，被称为共济蛋白(Q16595)。该前体蛋白质形式含有N-端的转运序列，所述转运序列将该前体蛋白质形式指引向线粒体基质，在线粒体基质中线粒体肽酶将其转化为成熟蛋白质共济蛋白的不同的更小的同种型(FXN42-210，FXN56-210，FXN81-210，FXN78-210)，其中130aa和14.2kDa的FXN81-210是最多的。在人中，在多种组织中在线粒体基质中检测到共济蛋白与其内膜结合，并且最高的水平在心脏组织、脊髓和分裂的成淋巴细胞中确定，并且明显地，小脑中水平最低。目前还没有在大脑皮质中检测到共济蛋白。因为确定了造成该疾病的基因并且产生了若干动物模型，推测共济蛋白有不同的功能，如线粒体铁体内平衡、铁存储、对氧化应激的应答、Fe-S簇的生物起源、线粒体顺乌头酸酶活性的调节和氧化磷酸化的调控。在FRDA中，由FXN基因中的GAA扩张的纯合子扩张产生的共济蛋白缺乏导致线粒体中的电子传送和顺乌头酸酶装配所需的铁-硫簇的生物合成不足，这导致线粒体功能失调和由于其体内平衡改变所致的线粒体铁累积。共济蛋白还调节蛋白质顺乌头酸酶1(ACO1)的DNA结合能力，所述酶除了参与线粒体基质中的柠檬酸循环外，还调控细胞铁的摄取和利用。通过基因操纵已经建立了弗里德希氏共济失调的若干动物和细胞模型。在小鼠中生成尽可能模拟人类疾病的AF模型一直是一项艰巨的任务，并且目前有8个不同的鼠FRDA模型。不幸的是，虽然它们可用于研究FRDA中分子神经变性过程的孤立的方面并用于评估具体症状中的不同疗法，但它们中没有一种是在同一动物中呈现FA所有表型症状(如背根神经节(DRG)和小脑齿状核中的损伤)的组合。临床前治疗中最常用的是Prp-CreERT和YG8R小鼠。Prp-CreERT小鼠特异性地发展出小脑和进行性感觉性共济失调，即弗里德希氏共济失调的最显著的神经学功能。这些动物中的组织学研究显示脊髓和背根神经节的异常而不存在运动神经病(人疾病的标志)，以及小脑的浦肯野细胞中的分枝缺陷。与此相比，YG8R转基因小鼠在不存在内源鼠共济蛋白的情况下显示缓慢进展的FRDA病状。与人相比，这些小鼠未显示心脏缺陷。在用于人病状的基因疗法中使用的病毒和非病毒载体中，来源于腺相关病毒(AAV)的载体已经显示重要的临床益处以及在戈谢病,法布里病，蓬佩病，异染性脑白质营养不良，尼曼氏病和黏多糖病I、II、IIIA、IIIB、IV和VII等的动物模型中的延迟表达。在溶酶体贮积病的动物模型中静脉内施用AAV载体导致在血液、肝脏、脾、肾和肌肉中酶活性增加至正常值的16倍，这使得其对于治疗此类病状非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含核酸的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸包含：/n(i)编码共济蛋白的核酸序列；/n(ii)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；和/n(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；/n其中(ii)和(iii)与(i)可操作连接并调控(i)的表达，其中在(i)和(ii)之间存在操作功能接头，并且其中所述接头由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的序列组成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171017 EP 17382691.81.包含核酸的腺相关病毒(AAV)载体，其中所述核酸包含：
(i)编码共济蛋白的核酸序列；
(ii)磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；和
(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)；
其中(ii)和(iii)与(i)可操作连接并调控(i)的表达，其中在(i)和(ii)之间存在操作功能接头，并且其中所述接头由SEQIDNO:6或与SEQIDNO:6具有至少95％同一性的序列组成。


2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述接头由SEQIDNO:6组成。


3.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于，所述PGK启动子包含SEQIDNO:1。


4.如权利要求1-3中任一项所述的载体，其特征在于，所述WPRE包含SEQIDNO:2。


5.如前述权利要求中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码共济蛋白的核酸序列包含SEQIDNO:3，或与SEQIDNO:3具有至少90％同一性并且是共济蛋白的功能变体的序列。


6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，包含(i)、(ii)、(iii)和所述接头的所述核酸的序列由SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有至少98％同一性的序列组成。


7.如前述权利要求中任一项所述的载体，其特征在于，所述AAV载体是AAV血清型9载体。


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【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·马蒂拉·杜埃尼亚斯，艾维丽斯·桑切斯·迪亚兹，爱德华·巴拉古·卡巴塞斯，
申请(专利权)人：日耳曼人特里亚斯艾普霍尔健康科学研究院基金会，吉恩特克公司，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES