多节孢酸(Nodulisporic acid)(NA)包含因其强效杀虫活性而为人所知的一组吲哚二萜类化合物；然而，NA通过其天然产生菌Hypoxylon pulicicidum(多节孢属物种(Nodulisporium sp.))的生物合成格外难以实现。负责NA生产的基因的鉴定可以使生物合成途径的优化成为可能，以提供获得用于商业化应用的NA的途径。使用已发表的发酵方法获得有用量的NA具有挑战性，使得基因敲除研究成为确认基因功能的不可取的方法。可选地，H.pulicicidum基因在更鲁棒的宿主物种如蕈青霉(Penicillium paxilli)中的异源基因表达提供了快速鉴定在NA生物合成中发挥作用的基因的功能的一种方式。在本工作中，我们鉴定了多节孢酸F(NAF)的生物合成必需的四个次级代谢基因的功能，并在蕈青霉(P.paxilli)的基因组中重建了这些基因，以便能够在这种真菌中异源生产NAF。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多节孢酸(Nodulisporicacid)的异源生物合成
本专利技术总的来说涉及催化产生多节孢酸(Nodulisporicacid)(NA)的至少一个生物化学反应的新的多肽，编码这些多肽的多核苷酸，制造这些多肽和多核苷酸的方法，以及使用这些多肽和多核苷酸通过在许可寄主中异源表达来生产至少一种NA的方法。
技术介绍
丝状真菌产生多种多样的有趣且有用的化学化合物。一类这样的化合物即吲哚二萜(IDT)的成员，由于其广泛的化学多样性和伴随的生物活性包括抗MRSA1、抗癌2，3、抗H1N14、杀虫5和致震颤6活性而特别受关注。NA(图1)是由以前被分类为多节孢属物种(Nodulisporiumsp.)的Hypoxylonpulicicidum产生的一组具有显著生物活性的准雀稗灵样IDT7。多节孢酸A(NAA)10是特别重要的，因为它表现出针对吸血节肢动物的强效杀虫活性，同时对哺乳动物没有表现出可观察的不良影响5，8。从天然生产菌H.pulicicidum生物合成NA特别困难。报道的NA生物合成方法要求H.pulicicidum在高度富含营养物的培养基中在完全黑暗下生长21天9。由于在H.pulicicidum中NAA10生物合成的困难性，因此使用已发表的发酵方法获得有用量的NAA10具有挑战性，并且商用量的NAA10的生产基本上无法实现。因此，已尝试化学合成NAA10，导致发现的合成多节孢酸F(NAF)5a10和多节孢酸D7a11的机制，但NAA10的全合成尚未实现12。因此，在本领域中对提供有用量的NAA10的NAA10合成和/或生物合成的新方法存在着需求。本专利技术的目的是提供编码H.pulicicidum的NAA10生物合成途径中的至少一种酶的多核苷酸，和/或提供使用这种载体在异源宿主中生产至少一种作为吲哚二萜化合物的NA和/或生产NAA10的前体的方法，和/或至少为公众提供有用的选择。在本说明书中，在对专利说明书、其他外部文献或其他信息源做出引用时，这通常是出于为本专利技术的特点的讨论提供背景的目的。除非另有特别说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何管辖范围内是先有技术或形成本领域公知常识的一部分。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及一种分离的多肽，其包含选自NodW(SEQIDNO：3)、NodR(SEQIDNO：6)、NodX(SEQIDNO：9)、NodM(SEQIDNO：12)、NodB(SEQIDNO：15)、NodO(SEQIDNO：18)、NodJ(SEQIDNO：21)、NodC(SEQIDNO：24)、NodY1(SEQIDNO：27)、NodD2(SEQIDNO：30)、NodD1(SEQIDNO：33)、NodY2(SEQIDNO：36)、NodZ(SEQIDNO：39)、NodS(SEQIDNO：50)和NodI(SEQIDNO：56)的氨基酸序列，或其有功能的变体或片段。另一方面，本专利技术涉及一种分离的多核苷酸，其编码包含选自NodW(SEQIDNO：3)、NodR(SEQIDNO：6)、NodX(SEQIDNO：9)、NodM(SEQIDNO：12)、NodB(SEQIDNO：15)、NodO(SEQIDNO：18)、NodJ(SEQIDNO：21)、NodC(SEQIDNO：24)、NodY1(SEQIDNO：27)、NodD2(SEQIDNO：30)、NodD1(SEQIDNO：33)、NodY2(SEQIDNO：36)、NodZ(SEQIDNO：39)、NodS(SEQIDNO：50)和NodI(SEQIDNO：56)的氨基酸序列的多肽或其有功能的变体或片段。另一方面，本专利技术涉及一种分离的多核苷酸，其与选自nodWcDNA(SEQIDNO：2)、nodW基因组DNA(SEQIDNO：1)、nodRcDNA(SEQIDNO：5)、nodR基因组DNA(SEQIDNO：4)、nodXcDNA(SEQIDNO：8)、nodX基因组DNA(SEQIDNO：7)、nodMcDNA(SEQIDNO：11)、nodM基因组DNA(SEQIDNO：10)、nodBcDNA(SEQIDNO：14)、nodB基因组DNA(SEQIDNO：13)、nodOcDNA(SEQIDNO：17)、nodO基因组DNA(SEQIDNO：16)、nodJcDNA(SEQIDNO：20)、nodJ基因组DNA(SEQIDNO：19)、nodCcDNA(SEQIDNO：23)、nodC基因组DNA(SEQIDNO：22)、nodY1cDNA(SEQIDNO：26)、nodY1基因组DNA(SEQIDNO：25)、nodD2cDNA(SEQIDNO：29)、nodD2基因组DNA(SEQIDNO：28)、nodD1cDNA(SEQIDNO：32)、nodD1基因组DNA(SEQIDNO：31)、nodY2cDNA(SEQIDNO：35)、nodY2基因组DNA(SEQIDNO：34)、nodZcDNA(SEQIDNO：38)、nodZ基因组DNA(SEQIDNO：37)、nodScDNA(SEQIDNO：49)、nodS基因组DNA(SEQIDNO：48)、nodIcDNA(SEQIDNO：55)和nodI基因组DNA(SEQIDNO：54)的核酸序列具有至少70％的核酸序列一致性。另一方面，本专利技术涉及一种转录单位(TU)，其包含至少一种根据本专利技术所述的分离的多核苷酸。另一方面，本专利技术涉及一种载体，其编码根据本专利技术所述的分离的多肽。另一方面，本专利技术涉及一种载体，其包含根据本专利技术所述的分离的核酸序列或TU。另一方面，本专利技术涉及一种分离的宿主细胞，其包含根据本专利技术所述的分离的多肽、分离的多核苷酸、TU和/或载体。另一方面，本专利技术涉及一种制造至少一种NA的方法，所述方法包括在分离的宿主细胞中异源表达根据本专利技术所述的至少一种多肽、分离的核酸序列、TU或载体。另一方面，本专利技术涉及至少一种NA，其通过本专利技术所述的方法制造。另一方面，本专利技术涉及一种来自于Hypoxylonspp.的分离的多肽或其有功能的片段或变体，其催化从3-香叶基香叶基吲哚(GGI)2产生NAA10的生物合成途径中的生物化学反应。另一方面，本专利技术涉及一种分离的多核苷酸，其编码来自于Hypoxylonspp.，催化从GGI2产生NAA10的生物合成途径中的生物化学反应的至少一种多肽或其有功能的变体或片段。另一方面，本专利技术涉及一种制造至少一种Hypoxylonspp.多肽或其有功能的变体或片段的方法，所述方法包括在分离的宿主细胞中异源表达根据本专利技术所述的分离的核酸序列或载体。另一方面，本专利技术涉及一种制造至少一种NA的方法，所述方法包括在分离的宿主细胞中异源表达催化从GGI2产生NAA10的生物合成途径中的生物化学反应的至少一种多肽。另一方面，本专利技术涉及一种分离的宿主细胞，其表达至少一种异源多肽，所述多肽催化导致从GGI2形成NAA10的生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离的多肽，其包含选自NodW(SEQ ID NO：3)、NodR(SEQ ID NO：6)、NodJ(SEQID NO：21)、NodY1(SEQ ID NO：27)、NodY2(SEQ ID NO：36)、NodX(SEQ ID NO：9)、NodM(SEQID NO：12)、NodB(SEQ ID NO：15)、NodO(SEQ ID NO：18)、NodC(SEQ ID NO：24)、NodD2(SEQID NO：30)、NodD1(SEQ ID NO：33)、NodZ(SEQ ID NO：39)和NodS(SEQ ID NO：50)的氨基酸序列，或其有功能的变体或片段。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170929 AU 20179039561.一种分离的多肽，其包含选自NodW(SEQIDNO：3)、NodR(SEQIDNO：6)、NodJ(SEQIDNO：21)、NodY1(SEQIDNO：27)、NodY2(SEQIDNO：36)、NodX(SEQIDNO：9)、NodM(SEQIDNO：12)、NodB(SEQIDNO：15)、NodO(SEQIDNO：18)、NodC(SEQIDNO：24)、NodD2(SEQIDNO：30)、NodD1(SEQIDNO：33)、NodZ(SEQIDNO：39)和NodS(SEQIDNO：50)的氨基酸序列，或其有功能的变体或片段。
2.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其与选自SEQIDNO：1、2、4、5、19、20、25、26、34、35、7、8、10、11、13、14、16、17、22、23、28、29、31、32、37、38、48和49的核酸序列具有至少70％、优选地至少80％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地99％的核酸序列一致性。
4.一种转录单位(TU)，其包含至少一种权利要求3所述的分离的多核苷酸。
5.一种载体，其编码权利要求1所述的分离的多肽。
6.一种载体，其包含权利要求2或3所述的分离的多核苷酸或权利要求4所述的TU。
7.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1所述的分离的多肽、权利要求2或权利要求3所述的分离的多核苷酸、权利要求4所述的TU和/或权利要求5或权利要求6所述的载体。
8.一种制造至少一种多节孢酸(Nodulisporicacid)(NA)的方法，所述方法包括在分离的宿主细胞中异源表达至少一种权利要求1所述的分离的多肽、权利要求2或权利要求3所述的分离的多核苷酸、权利要求4所述的TU和/或权利要求5或权利要求6的载体。
9.一种来自于Hypoxylonspp.的分离的多肽或其有功能的片段或变体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·尼古尔森，S·A·凯珊，E·J·帕克，L·Y·布斯塔曼特·罗德里格斯，D·B·斯科特，K·C·范·德·比特纳，C·J·范·杜勒维勒，
申请(专利权)人：维多利亚联结有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰;NZ
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