一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法。本发明专利技术通过物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证相结合，形成一套科学合理，准确高效的检测鉴定方法，具有简单易行、准确度高的特点。在截留率、鉴定及假阳性率三个方面取得了核心技术突破性进展，开发了相应的检测设备和配套试剂，开展了临床研究，产生了重要的经济和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法。
技术介绍
技术的不断改进和发展，CTCs的研究已成为当前肿瘤学研究的热点：不仅有助于对肿瘤转移机制的了解，而且在临床上有助于发现早期微转移、评估预后、评价治疗效果和实现个体化药物治疗。CTCs检测首先要把血液中的肿瘤细胞和血细胞分离开来，分离方法有两大类：一类是根据细胞的特异性生物标记来富集，采用这一技术路线的主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪（MACS）、AdnaTest癌细胞检测系统、莱尔系统等。另一类是根据CTCs和血细胞物理特性的不同进行分离富集，包括密度梯度离心法和膜滤过分离肿瘤细胞法（Isolationbysizeofepithelialtumorcells，ISET）。目前，已有至少53种以上基于上述理论方法的检测技术体系被报道，但没有一种方法能够将CTCs没有遗漏地检测出来。CTCs检测成为制约CTCs临床应用的瓶颈。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位，对于循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术进行产业化推广的研究，本项目为山东省重大科技创新工程项目，本项目将以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行产业化推广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种将多种检测技术手段相结合，科学合理、准确高效的的循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法。本专利技术是通过以下技术手段来实现的：一种循环肿瘤细胞CTCs的检测鉴定方法，采用物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证。所述的物理方法捕获为：a.采集癌症患者外周血，盛于血样容器中；b.血样容器的下方连接一带有过滤膜的过滤器，将外周血经过滤器过滤；所述过滤膜上均匀布满直径为10-25微米的滤孔；c．过滤完成后，进行瑞氏液染色，PBS缓冲液冲洗干净，取下滤膜，收集过滤膜上的循环肿瘤细胞CTCs。所述的形态方法识别为：将收集的循环肿瘤细胞CTCs，放置到电子显微镜下，统计循环肿瘤细胞CTCs的数量，测量循环肿瘤细胞CTCs的尺寸，并记录循环肿瘤细胞CTCs的形态，并将其与标准的循环肿瘤细胞CTCs相对比，判断其类别。所述的免疫方法验证为：将收集的循环肿瘤细胞CTCs加入脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；室温孵育；滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；返蓝后的CTC采用75%乙醇，95%乙醇，100%乙醇梯度乙醇脱水各10min，然后加入15mL试剂A，振荡均匀后过滤；加入试剂B，脱色30min，干燥，中性树脂封固；光学显微镜下镜检。上述的检测方法的装置，所述的捕获用的装置有铁架台，铁架台的上方固定有血样容器，血样容器的下方连接有滤器，滤器内固定有滤膜；滤器的下方分别有输液器和废液缸；所述的滤膜均匀布满有向下凹的滤孔，所述的滤孔上孔直径为40-60微米，下孔直径为10-18微米，下凹的深度为10-20微米，上孔与下孔之间呈圆弧状。本专利技术的有益效果是，通过物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证相结合，形成一套科学合理，准确高效的检测鉴定方法，具有简单易行、准确度高的特点。申请人针对CTCs检测技术体系中关键步骤：富集和鉴定进行攻关，提出了：“物理方法捕获，形态方法识别，免疫方法验证”的解决方案，在截留率、鉴定及假阳性率三个方面取得了核心技术突破性进展，开发了相应的检测设备和配套试剂，开展了临床研究，产生了重要的经济和社会效益。附图说明：图1是本专利技术的物理方法捕获的结构示意图。图2是本专利技术的过滤膜的俯视图结构示意图。图3是本专利技术的过滤膜的剖面图结构示意图。图4是截留肿瘤细胞示意图。图5是胰腺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图。图中1.铁架台2.血样容器3.滤器4.输液器5.废液缸。具体实施方式实施例1本专利技术的过滤装置如图1所示，包括有铁架台1，铁架台1的上方固定有血样容器2，血样容器2的下方连接有滤器3，滤器3内固定有滤膜，滤器3的下方分别有输液器4和废液缸5。如图2所示，所述的滤膜均匀布满有向下凹的滤孔，所述的滤孔上孔直径为50微米，下孔直径为12微米，下凹的深度为15微米，上孔与下孔之间呈圆弧状。由于本专利技术将滤膜制成下凹的滤孔，普通细胞可以通过下孔流出，由于循环肿瘤细胞不能通过下孔，因而保留在滤孔内。本专利技术由于将滤孔制成圆弧状的凹孔，可以最大限度地保留了循环肿瘤细胞原有的形态，避免了循环肿瘤细胞的变形，为下一步的形态识别提供了保障。以胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1为例：获取循环肿瘤微栓的方法，具体采用以下步骤:分离获取癌症患者外周血5毫升，将外周血经过滤器过滤，过滤完成后，从过滤装置中取下滤器，打开并移走滤器上口，将瑞氏染色液加入到滤器中，A、B染液各染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜，收集过滤膜上的循环肿瘤细胞CTCs。将收集的循环肿瘤细胞CTCs，放置在载玻片上，直接在显微镜下观察CTM形态特征。统计循环肿瘤细胞CTCs的数量，测量循环肿瘤细胞CTCs的尺寸，并记录循环肿瘤细胞CTCs的形态，并将其与标准的循环肿瘤细胞CTCs相对比，判断其类别。如图4所示，从图中可以看出，分离出长约30微米、宽约18微米的循环肿瘤微栓。因血样是依靠重力自然滤过，并且采用圆弧形的滤孔，所以分离获得的循环肿瘤微栓形态及免疫特征均不受破坏。免疫方法验证如下：将分离的循环肿瘤细胞置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环肿瘤细胞CTCs的检测方法，其特征在于：采用物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证。/n

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞CTCs的检测方法，其特征在于：采用物理方法捕获、形态方法识别、免疫方法验证。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的物理方法捕获为：
a.采集癌症患者外周血，盛于血样容器中；
b.血样容器的下方连接一带有过滤膜的过滤器，将外周血经过滤器过滤；所述过滤膜上均匀布满直径为10-25微米的滤孔；
c．过滤完成后，进行瑞氏液染色，PBS缓冲液冲洗干净，取下滤膜，收集过滤膜上的循环肿瘤细胞CTCs。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的形态方法识别为：将收集的循环肿瘤细胞CTCs，放置到电子显微镜下，统计循环肿瘤细胞CTCs的数量，测量循环肿瘤细胞CTCs的尺寸，并记录循环肿瘤细胞CTCs的形态，并将其与标准的循环肿瘤细胞CTCs相对比，判断其类别。


4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的免疫方法验证为：将收集的循...

【专利技术属性】
技术研发人员：李胜，崔凯，王振丹，邹本奎，王焕昇，沈阳洋，李浩，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：山东;37