一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。本发明专利技术还提供了一种突变的Cpf1蛋白以及包含其的核酸检测试剂盒。本发明专利技术还提供了一种检测冠状病毒核酸的crRNA及包含其的核酸检测试剂盒。本发明专利技术进一步提供了所述核酸检测试剂盒的应用及核酸的检测方法。利用本发明专利技术的核酸检测试剂盒、突变的Cpf1蛋白或crRNA检测核酸(例如检测SARS相关冠状病毒或MERS冠状病毒的核酸)时，可显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种包括Cpf1检测体系的核酸检测试剂盒、检测方法。本专利技术还涉及所述核酸检测试剂盒的应用，特别是在严重急性呼吸综合征相关冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒的核酸的快速检测中的应用。
技术介绍
冠状病毒属于套式病毒目Nidovirales，冠状病毒科Coronaviridae，冠状病毒属Coronavirus[6]。成熟的冠状病毒表面有囊膜，囊膜表面覆有纤突，纤突末端呈球形，故整个纤突呈花瓣状或梨状，纤突之间有较宽的间隙。电镜下，囊膜纤突规则地排列成王冠状，病毒颗粒因此而得名。目前尚无针对高度传染性的冠状病毒的有效疫苗和治疗药物，及时诊断和隔离是控制该病暴发流行的有效方法。快速、高效的核酸快速检测是临床上病毒性疾病防控的有效方法，针对病毒性疾病现有的检测方法多以核酸检测为主，WHO发布的严重急性呼吸系统综合症(SevereAcuteRespiratorySyndrome，缩写为SARS)和中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus，MERS-CoV)的实验室确诊程序指导文件中推荐使用实时反转录聚合酶链式反应(realtimereversetranscriptionPCR，rRT-PCR)方法对病毒进行检测确诊。rRT-PCR检测病毒核酸主要受制于：昂贵的PCR实验设备、能进行熟练稳定操作的工作人员人数、检测时间较长等。免疫学检测方法也是病毒检测的重要手段，如双抗体夹心ELISA、胶体金免疫层析试纸等方法。免疫学检查容易受到病程的影响，早期病人体内抗体较少，需要等待一定的时间才可以产生相应的抗体，容易出现漏诊；患病后的康复病人体内可能携带该类抗体，容易导致免疫诊断出现假阳性。为了有效的控制病毒性传染疾病的传播，需要建立一种简便、快速、特异的新型检测方法。CRISPR-Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs)是细菌中的一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸[1,2]。其中，CRISPR-Cpf1(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)[3]，催化它们自身的指导CRISPRRNA(crRNA)成熟[4]，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)[3]。当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性[5]。Cpf1是具有核酸内切酶活性，核酸内切酶的配体离子通常为镁离子。现有以Cpf1为基础的核酸检测，信号强度仍旧不高，从而导致在实际检测中的检测时间过长，低浓度样品检测效率低等缺陷。因此还需要进一步增强检测信号的强度以满足实际检测的需要。此外，在检测核酸时的灵敏度、特异性和稳定性也迫切需要提高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中检测核酸时成本过高、检测试剂较长、检测效率低、特异性和灵敏性不够高等缺陷，提供了一种核酸检测试剂盒、一种突变的Cpf1蛋白、一种crRNA、检测方法及应用。利用本专利技术所述的核酸检测试剂盒、突变的Cpf1蛋白或crRNA检测核酸(例如检测SARS相关冠状病毒或MERS冠状病毒的核酸)时，可以显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。Cpf1是具有核酸内切酶活性，而在本领域中核酸内切酶的配体离子通常为镁离子。而本专利技术人首次发现锰离子能够促进Cpf1对核酸探针(例如单链DNA探针)的切割能力，进而提高Cpf1检测的信号强度，从而可用于增强Cpf1介导的体外检测的信号以减少检测时间、提高检测效率。此外，本专利技术还通过大量实验，意外发现当将某些Cpf1蛋白进行特定突变后，也能够显著提高检测核酸时的信号强度。本专利技术人还首次采用Cpf1荧光法检测SARS相关冠状病毒和MERS冠状病毒，经过大量实验摸索设计出能够用于检测这些病毒的crRNA，将其用于检测病毒时灵敏度和特异性非常高，且准确性也很高。为了解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。较佳地，所述含锰离子的溶液为硫酸锰、氯化锰或醋酸锰溶液。较佳地，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记，更优选在其5’端和3’端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在其5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团。其中，所述荧光基团可以为本领域常规，例如为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX。所述荧光淬灭基团可以为本领域常规，例如为BHQ1、BHQ2或BHQ3。所述单链DNA探针的序列按照本领域常规方法进行制备，例如可以为TTTATTT。较佳地，所述Cpf1蛋白选自AsCpf1(Acidaminococcussp.BV3L6)、BbCpf1(BeauveriabassianaKA00251)、BoCpf1(Bacteroidetesoral)、FnCpf1(FrancisellanovicidaU112)、HkCpf1(Helcococcuskunzii)、Lb4Cpf1(LachnospiraceaebacteriumMC2017)、Lb5Cpf1(LachnospiraceaebacteriumNC2008)、LbCpf1(LachnospiraceaebacteriumND2006)、Oscpf1(Oribacteriumsp.)和TsCpf1(Thiomicrospirasp.XS5)中的一种或多种。较佳地，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，其核苷酸序列优选如SEQIDNO.14-23中的一个或多个所示。较佳地，所述Cpf1蛋白为突变的Cpf1蛋白，所述突变的Cpf1蛋白优选其氨基酸序列与天然Cpf1蛋白具有98％优选99％以上的序列同源性。更佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQIDNO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位点突变为R后的序列，或将如SEQIDNO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一个或多个位点突变为R后的序列。例如可以是将如SEQIDNO.55所示的E184和N607突变为R后的序列，可以是将如SEQIDNO.55所示的E184、N607和K613突变为R后的序列，可以是将如SEQIDNO.55所示的K180、E184、N607和K613突变为R后的序列，可以是将如SEQIDNO.54所示的T152和G532突变为R后的序列，可以是将如SEQIDNO.54所示的T152、G532和K5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。/n

【技术特征摘要】
20200401 CN 20201025136761.一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。


2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述含锰离子的溶液为硫酸锰、氯化锰或醋酸锰溶液；
和/或，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记，更优选在其5’端和3’端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在其5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团；所述荧光基团优选为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA探针的序列例如为TTTATTT；
和/或，所述Cpf1蛋白选自AsCpf1、BbCpf1、BoCpf1、FnCpf1、HkCpf1、Lb4Cpf1、Lb5Cpf1、LbCpf1、Oscpf1和TsCpf1中的一种或多种；
和/或，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，其核苷酸序列优选如SEQIDNO.14-23中的一个或多个所示；
和/或，所述Cpf1蛋白为突变的Cpf1蛋白，所述突变的Cpf1蛋白优选其氨基酸序列与天然Cpf1蛋白具有98％优选99％以上的序列同源性；所述突变的Cpf1蛋白的序列更优选包括将如SEQIDNO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位点突变为R后的序列，或将如SEQIDNO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一个或多个位点突变为R后的序列；进一步更优选包括将如SEQIDNO.55所示的E184和N607，E184、N607和K613，或K180、E184、N607和K613突变为R后的序列，或将如SEQIDNO.54所示的T152和G532，T152、G532和K538，或T148、T152、G532和K538突变为R后的序列；最优选其核苷酸序列如SEQIDNO.30-41所示。


3.如权利要求1或2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的RNA，优选为crRNA；所述crRNA优选为检测病毒核酸的crRNA；更优选为检测SARS相关冠状病毒或MERS-CoV病毒的crRNA；所述SARS相关冠状病毒优选为冠状病毒SARS-CoV或SARS-CoV-2；
较佳地，所述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，所述upE基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQIDNO.46所示；所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQIDNO.79所示；所述SARS-CoV-2-M基因的核苷酸序列如SEQIDNO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸序列如SEQIDNO.81所示；
更佳地，所述crRNA的核苷酸序列优选如SEQIDNO.1-10、SEQIDNO.47、SEQIDNO.48和SEQIDNO.53、SEQIDNO.56-72中的一个或多个所示。


4.如权利要求1～3任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述含锰离子的溶液中锰离子的浓度为5-600mM，优选100mM；
和/或，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL；
和/或，所述Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL；
和/或，所述向导RNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM；
和/或，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL；所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。


5.一种突变的Cpf1蛋白，其特征在于，其序列包括将SEQIDNO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位点突变为R后的序列；或者，其序列包括将SEQIDNO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一个或多个位点突变为R后的序列；
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQIDNO.55所示的E184和N607，E184、N607和K613，或K180、E184、N607和K613突变为R后的序列，或将如SEQIDNO.54所示的T152和G532，T152、G532和K538，或T148、T152、G532和K538突变为R后的序列；
更佳地，所述突变的Cpf1蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.30-41所示。


6.一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、核酸探针和如权利要求5所述的突变的Cpf1蛋白；
较佳地，所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的RNA，优选为crRNA；所述crRNA优选为检测病毒核酸的crRNA；更优选为检测SARS相关冠状病毒或MERS-CoV病毒的crRNA；所述SARS相关冠状病毒优选为冠状病毒SARS-CoV或SARS-CoV-2；所述crRNA优选为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，所述upE基因的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQIDNO.46所示，所述SARS-Co...

【专利技术属性】
技术研发人员：马培翔，王鑫杰，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海;31