一体化分子诊断系统及其在追溯β冠状病毒动物来源的应用技术方案

本发明专利技术提供了一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其中包括分别针对β冠状病毒A普系、B普系、C普系及C普系MERS，和/或D普系的引物和探针；本发明专利技术还提供18S rRNA序列作为在哺乳动物和禽类的病毒检测中作为内参基因的应用。进一步提供一种用于一体化检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其包括上述的试剂盒包装成的反应液，还包括裂解提取液和清洗液。本发明专利技术通过引物和探针的设计，使得在一个反应里同时能检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2，SARS病毒以及MERS病毒等动物源性β冠状病毒，从而在一个反应里实现对三大烈性的高传染性呼吸系统病原体的全覆盖，对于其动物溯源，具有较高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一体化分子诊断系统及其在追溯β冠状病毒动物来源的应用
：本专利技术属于分子生物学，尤其涉及病毒的检测，更具体涉及β冠状病毒溯源的检测。
技术介绍
：对于病原体为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测，科学家已经提供了检测引物和探针(http://www.chinaivdc.cn/)。疫情严重，寻找传染源、弄清传播途径是社会各界观注的重要问题。中国科学院武汉病毒研究所石正丽团队研究表明这次新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与一株蝙蝠体内分离到的冠状病毒序列一致性高达96％(ZhouP,YangXL,WangXG,etal.Discoveryofanovelcoronavirusassociatedwiththerecentpneumoniaoutbreakinhumansanditspotentialbatorigin.bioRxiv2020)，可以将天然宿主基本锁定在蝙蝠。然而，蝙蝠体内常在的冠状病毒能否直接感染人类并未可知？SARS-CoV-2是否通过某些中间宿主传染到人？为了回答上述问题，大量的动物溯源工作需要进行。这对于明确SARS-CoV-2传染源、切断传播途径具有重大的意义。2020年2月7日华南农业大学通报，其与合作机构对动物园野生动物的潜在冠状病毒进行宏基因组学分析，并通过分子生物学检测，揭示穿山甲中β冠状病毒的阳性率为70％；进一步对病毒进行分离鉴定，电镜下观察到典型的冠状病毒颗粒结构；最后通过对病毒的基因组分析，发现宏基因拼接出来的毒株序列与目前感染人的毒株序列相似度高达99％，确定穿山甲是可能的潜在宿主。除穿山甲外，还有哪些物种可能作为本次疫情大暴发的中间宿主值得深入研究。PCR等分子生物学技术因其快速、灵敏等优点，在疾病诊断中的作用越来越明显。尤其是多重荧光定量PCR能够同时检测多种病原体，在呼吸系统疾病诊断上发挥了巨大的作用(Brittain-LongR,NordS,OlofssonS,etal.Multiplexreal-timePCRfordetectionofrespiratorytractinfections.JClinVirol.2008,41(1):53-56.)，例如应用于SARS病毒的检测(HadjinicolaouAV,FarcasGA,DemetriouVL,etal.Developmentofamolecular-beacon-basedmulti-allelicreal-timeRT-PCRassayforthedetectionofhumancoronaviruscausingsevereacuterespiratorysyndrome(SARS-CoV):ageneralmethodologyfordetectingrapidlymutatingviruses.ArchVirol.2011Apr；156(4):671-80.)。但是，由于荧光定量PCR超高的敏感性，容易形成气溶胶污染从而造成假阳性。而且，对操作人员的专业技术要求高，也需要严格的实验室分区，还需要前期的核酸提取等步骤。这从一定程度上限制了荧光定量PCR技术的应用。基于微流控技术的PCR即时检测(point-of-caretesting,POCT)是目前国际基因检测的前沿技术之一(VashistSK.Point-of-CareDiagnostics:RecentAdvancesandTrends.Biosensors(Basel).2017,7(4).pii:E62.)，将核酸提取与荧光定量基因检测通过微流控卡槽相结合，实现了样本到基因检测结果的全封闭自动输出，将整体检测时间控制在1小时左右。目前以美国Cepheid公司和罗氏公司为首的国际公司纷纷推出了分子POCT仪器和试剂卡槽的荧光定量PCR试剂盒，其快速、无污染、不需要专业人员操作等特性，使之在欧美等发达国家广泛应用。我国在该领域也在持续的研发与推进，但目前上市的产品较少，尤其是针对追溯β冠状病毒中的检测手段有待进一步加强。
技术实现思路
：本专利技术的目的是针对SARS-CoV-2的动物溯源、寻找病毒中间宿主而开发的。本专利技术整合SARS-CoV-2与动物源冠状病毒RNA的提取、RNA反转录为cDNA分子、多重荧光定量PCR扩增及可视化结果输出为一体,为动物溯源和寻找病毒中间宿主提供了一整套解决方案。一是本专利技术通过对各种动物种属的冠状病毒进行序列比对，分析保守区域及二级结构。设计了一整套通用型冠状病毒扩增引物及探针，用于检测动物源冠状病毒，以便寻找SARS-CoV-2的中间宿主。当然本专利技术同时还可适用对于SARS和MERS的检测。这样能够解决检测中的下述问题：现有分子扩增只针对SARS-CoV-2，只能对是否存在2019年新型冠状病毒进行确诊。无法检测与SARS-CoV-2相近的动物源冠状病毒。因为包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒属于RNA病毒，RNA病毒具有较高的突变率，如果蝙蝠体内的冠状病毒经由某种或者某些中间宿主传染给人，那么这些中间宿主体内的冠状病毒与SARS-CoV-2序列是存在差异的。只用针对SARS-CoV-2的特异性引物进行检测，则无法检测出与SARS-CoV-2相近但有差异的动物冠状病毒，那就无法检测病毒的中间宿主。其次是针对的病毒RNA的提取与后续的分子扩增是分隔开来的，步骤繁多，且人工提取病毒RNA会增加人力成本、时间成本，且批量样本中存在样本间均一性不够的问题，会受人为操作因素的影响。因此，还需进一步完善一体化检测，通过一体化检测实现样本的裂解、核酸的提取、RNA的反转录、多重荧光定量PCR反应、结果的可视化输出的一体化、全封闭反应。因此，本专利技术首先提供一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其选自下述组合之一或多种：(1)针对β冠状病毒A普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，探针序列为SEQIDNO.3所示；(2)针对β冠状病毒B普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，探针序列为SEQIDNO.6所示；(3)针对β冠状病毒C普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，探针序列为SEQIDNO.9所示；(4)针对β冠状病毒C普系MERS引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，探针序列为SEQIDNO.12所示；(5)针对β冠状病毒D普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示，探针序列为SEQIDNO.15所示。进一步地，对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用CY5修饰，3’端用BHQ2修饰。本专利技术还提供18SrRNA序列作为在哺乳动物和禽类的病毒检测中作为内参基因的应用。进一步地，其作内参基因的引物对序列分别如SEQIDNO.16和SEQIDNO.17所示，探针序列为SEQIDNO.18所示；优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其选自下述组合之一或多种：/n(1)针对β冠状病毒A普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，探针序列为SEQ ID NO.3所示；/n(2)针对β冠状病毒B普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，探针序列为SEQ ID NO.6所示；/n(3)针对β冠状病毒C普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，探针序列为SEQ ID NO.9所示；/n(4)针对β冠状病毒C普系MERS引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示，探针序列为SEQ ID NO.12所示；或/n(5)针对β冠状病毒D普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示，探针序列为SEQ ID NO.15所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其选自下述组合之一或多种：
(1)针对β冠状病毒A普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，探针序列为SEQIDNO.3所示；
(2)针对β冠状病毒B普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，探针序列为SEQIDNO.6所示；
(3)针对β冠状病毒C普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，探针序列为SEQIDNO.9所示；
(4)针对β冠状病毒C普系MERS引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，探针序列为SEQIDNO.12所示；或
(5)针对β冠状病毒D普系引物和探针，其引物对序列分别如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示，探针序列为SEQIDNO.15所示。


2.如权利要求1所述的用于检测β冠状病毒的引物和探针组合，其特征在于：对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用CY5修饰，3’端用BHQ2修饰。


3.18SrRNA序列作为在哺乳动物和禽类的病毒检测中作为内参基因的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其作内参基因的引物对序列分别如SEQIDNO.16和SEQIDNO.17所示，探针序列为SEQIDNO.18所示；优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。


5.一种检测动物中β冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2中的第(1)至第(5)项的检测引物和探针组合的一组或多组进一步地这些引物和探针组合单独包装或混和包装；优选地，还包括内参基因的引物和探针组合，进一步优选还包括公认的检测SARS-CoV-2的引物组和探针组合，更具体地，其引物如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示，探针如SEQIDNO.21所示，和/或引物如SEQIDNO.22和SEQIDNO.23所示，探针如SEQIDNO.24；更进一步地，对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5’端用FAM修饰，3’端...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永强，陈蕾，
申请(专利权)人：泰州蕾灵百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32