一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学检测技术与精准医学领域，具体涉及一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用。所述寡核苷酸引物包括具有3’端和5’端的3p臂、发夹环以及具有3’端和5’端的5p臂，5p臂不与DNA模板结合，3p臂与DNA模板杂交，同时提供聚合酶延伸的序列特异性；发夹环位于5p臂和3p臂之间，发夹环包括与DNA模板杂交的单链环与双链茎，寡核苷酸引物与DNA模板结合时，单链环与DNA模板之间的结合能大于双链茎之间的结合能。本发明专利技术还提供了一种试剂盒及其在多重PCR中的应用。解决了现有引物特异性低、均一性差及检测灵敏度偏差大，及多重PCR引物二聚体形成、扩增偏好性和错配率高的问题，使多重PCR的效果稳定可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用
本专利技术属于分子生物学检测技术与精准医学领域，具体涉及一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用。
技术介绍
随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，其在生命科学及医学领域方面的研究和应用越来越广泛，特别是在疾病诊断及预防中发挥重要作用，其主要表现在产前筛查、肿瘤诊断、重大疾病预防、健康相关宏基因组分析等方面。虽然人类全基因组测序从测序时间和资金花费上已有了巨大的飞跃，但庞大的数据分析和遗传信息提取费时费力，相比较而言，扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究。这种高针对性的方法可以高效地发现、验证和筛选关注区域的基因组变异。相比全基因组测序，扩增子测序对目标区域有更准确快速的研究，适用于大量样本的特定基因组区域研究，更有利于用于临床疾病检测。采用高通量基因测序技术检测基因突变，需要进行测序前样本文库的制备。目前测序文库构建的方式主要有两种，一种是使用专门的试剂盒进行的探针捕获法建库，一种是使用扩增子PCR的方式进行建库。其中，使用试剂盒进行建库的优点是标准化程度高，适用性强，可针对各种长度的PCR产物；但缺点是试剂昂贵，操作流程比较繁琐。而扩增子建库则简单、便宜许多，但是目前技术中，扩增子建库方法多为只针对一个单独的靶基因进行扩增建库，如果想对多个不同的靶基因进行一次性建库则需要一个个进行单基因扩增重复或者采用多重PCR，但是多重或超高重PCR方法进行目标区域扩增，可能会存在扩增偏向性、扩增突变等因素导致目标区域扩增不均一，从而对后续测序数据产生偏向性影响。多重PCR的主要限制因素包括引物二聚体的形成、扩增偏好性和错配率高。为了解决上述问题，现有技术的解决方法之一是利用Omegaprimer(Ω引物)，Omegaprimer是由3个功能区段组成：3p臂(3parm)是聚合酶延伸反应的启动子；5p臂(5parm)是结合DNA模板序列的锚；分隔两臂的环(loop)：用于设计单重PCR的通用引物区。相比于传统引物，OmegaPrimer具有以下特点：大幅提升特异性——omegaprimer需要3p臂和5p臂同时特异结合模板(templateDNA)。具有宽容模板变异的能力。大幅降低引物二聚体。扩增子中容纳更长的真实序列。但Ω引物在扩增时，环状部分并不打开，在解决特异性低、均一性差及检测灵敏度偏差大的技术问题是还有改进的空间。如上所述，现有技术中仍需要用于大量特异性核酸分子同时多重扩增的方法，所述方法能阻止非特异性引物二聚体的形成，消除靶特异性引物扩增的偏差及PCR扩增本身存在突变所导致的假阳性。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题针对现有技术中多重PCR存在扩增偏向性、扩增突变等因素导致目标区域扩增不均一，对后续测序数据产生偏向性影响，且现有技术中Ω引物特异性低、均一性差及检测灵敏度偏差大的问题。本方案提供了一种寡核苷酸引物、试剂盒及其应该方法，解决了现有技术中引物存在的二聚体的形成、扩增偏好性和错配率高的技术问题，使多重PCR的效果稳定可靠。2.技术方案为达到上述目的，提供的技术方案为：本专利技术的一种寡核苷酸引物，包括具有3’端和5’端的3p臂、发夹环以及具有3’端和5’端的5p臂，所述5p臂不与DNA模板结合，所述3p臂与DNA模板杂交，同时提供聚合酶延伸的序列特异性；所述发夹环位于5p臂和3p臂之间，所述发夹环包括与DNA模板杂交的单链环与双链茎，所述寡核苷酸引物与DNA模板结合时，所述单链环与DNA模板之间的结合能大于双链茎之间的结合能。进一步地，所述3p臂是从5到15个核苷酸长度；所述5p臂包括UMI序列和通用锚定序列，所述UMI序列是5～10个随机核苷酸N，所述N是A、T、C或G中的任一个。进一步地，所述3p臂是从10到15个核苷酸长度；所述UMI序列是7～8个随机核苷酸N，所述N是A、T、C或G中的任一个。一种试剂盒，包括所述的一种寡核苷酸引物。进一步地，所述试剂盒还包括利用所述寡核苷酸引物进行多重PCR反应的试剂。进一步地，所述试剂包括缓冲液、DNA聚合酶和dNTP的混合物。一种利用所述的试剂盒扩增两个或更多不同靶核酸的方法，包括以下步骤：提供至少一组特异性引物对，所述特异性引物对包括第一特异性引物和第二特异性引物，且专为特定靶核酸设计；提供至少一组通用引物，所述通用引物包括第一通用引物和第二通用引物；提供一组靶核酸；所述第一特异性引物和第二特异性引物为所述寡核苷酸引物；进行2～5轮第一热循环过程，该过程包括变性步骤、退火步骤和延伸步骤；进行10～30轮第二热循环过程，优选地选择20个循环，该过程包括变性步骤、退火步骤和延伸步骤。进一步地，所述第一特异性引物和第二特异性引物终浓度为2nM～100nM；所述第一通用引物和第二通用引物终浓度为400nM～1μM。进一步地，所述第一特异性引物和第二特异性引物终浓度为5nM～50nM，进一步的可以是10nM～40nM；所述第一通用引物和第二通用引物终浓度为500nM～800nM。进一步地，第一热循环的变性步骤温度为95℃，时间为15s，退火步骤温度为54℃，时间为30s～5min，优选地3～4min，延伸步骤温度为72℃，时间为30s；第二热循环的变性步骤温度为95℃，时间为15s，退火步骤温度为60℃，时间为30s，延伸步骤温度为72℃，时间为30s。3.有益效果采用本专利技术提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：(1)本专利技术的一种寡核苷酸引物，结构上类似现有技术中的Ω引物，但与已公开的Ω引物在结构上有本质的区别，已公开的Ω引物的环结构是由引物与模板序列之间的杂交相互作用所形成的。而本专利技术所述的类Omega引物是通过理论计算进行设计的在设计引物本身时带有发夹环结构，当引物与模板序列杂交相互作用后，环结构消失(附图1)，从实际效果看，本申请的引物从PCR扩增的特异性、均一性及检测灵敏度均优于普通Ω引物。(2)本专利技术的一种试剂盒极其应用，可简化扩增子测序中建库步骤的操作过程，降低扩增子测序建库的时间和成本，同时保证不影响测序质量。其独特的类Ω引物设计技术，可以有效避免非特异性引物二聚体的形成，解决多重PCR扩增的非特异性瓶颈，使得单管PCR可以实现100重以上PCR扩增，优化的反应体系和扩增程序可有效解决文库的覆盖度和均一性差的技术问题。(3)本专利技术的一种试剂盒极其应用，包括在靶筛选阶段使所有扩增子目的片段的5’端加上UMI单分子标签，在文库富集阶段用第一通用引物和第二通用引物扩增靶序列，每个通用引物包括引发区段(即通用区段序列)和标记区段，用于产生含有单链标记的PCR产物，目的是将不同样本、不同靶序列加上样本区分标签、测序接头序列和测序标签序列，完成测序文库构建，这样可大大地节省试剂和减少工作量。(4)本专利技术主要通过优化反应体系中类Ω引物与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡核苷酸引物，包括具有3’端和5’端的3p臂、发夹环以及具有3’端和5’端的5p臂，其特征在于：所述5p臂不与DNA模板结合，所述3p臂与DNA模板杂交，同时提供聚合酶延伸的序列特异性；所述发夹环位于5p臂和3p臂之间，所述发夹环包括与DNA模板杂交的单链环与双链茎，所述寡核苷酸引物与DNA模板结合时，所述单链环与DNA模板之间的结合能大于双链茎之间的结合能。/n

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸引物，包括具有3’端和5’端的3p臂、发夹环以及具有3’端和5’端的5p臂，其特征在于：所述5p臂不与DNA模板结合，所述3p臂与DNA模板杂交，同时提供聚合酶延伸的序列特异性；所述发夹环位于5p臂和3p臂之间，所述发夹环包括与DNA模板杂交的单链环与双链茎，所述寡核苷酸引物与DNA模板结合时，所述单链环与DNA模板之间的结合能大于双链茎之间的结合能。


2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸引物，其特征在于：所述3p臂是从5到15个核苷酸长度；所述5p臂包括UMI序列和通用锚定序列，所述UMI序列是5～10个随机核苷酸N，所述N是A、T、C或G中的任一个。


3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸引物，其特征在于：所述3p臂是从10到15个核苷酸长度；所述UMI序列是7～8个随机核苷酸N，所述N是A、T、C或G中的任一个。


4.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～3任一项所述的一种寡核苷酸引物。


5.根据权利要求4所述的一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括利用所述寡核苷酸引物进行多重PCR反应的试剂。


6.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于：所述试剂包括缓冲液、DNA聚合酶和dNTP的混合物。


7.一种利用权利要求4-6任一项所述的试剂盒扩增两个或...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文干，蒋艳鑫，韦玉军，
申请(专利权)人：安徽安龙基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34