一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途制造技术

本发明专利技术涉及定点突变、定点修饰的蛋白抗原。本发明专利技术还涉及定点突变和定点修饰蛋白抗原的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入到蛋白抗原特定位点，借助非天然氨基酸与修饰剂，所述修饰剂如三棕榈酰‑S‑甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A等受体激动剂，与蛋白抗原定点修饰。本发明专利技术进一步涉及定点突变、定点修饰的蛋白抗原的应用，如作为疫苗等用途。

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途
本专利技术涉及生物制药领域，具体地说，本专利技术涉及一种定点突变、定点修饰的蛋白质及其在制备疫苗，特别是脑膜炎球菌多价疫苗中的用途。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseriameningococcus,Nm）感染所致的流行性脑脊髓膜炎（流脑），是一种世界范围内致病的急性呼吸道传染病，至今仍严重危害着人类健康，尤其是儿童。脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖结构的差异可分为13个血清群，且所有血清群均可致病。其中A、B、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏菌所致病约占脑膜炎奈瑟氏菌相关疾病的95%以上。其中，基于A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖和多糖-蛋白结合的各种单价（A或C）、双价（A\C）和四价（ACYW135）疫苗，在预防侵袭性疾病、控制疾病流行和爆发中起到了十分关键的作用和理想效果，有效控制了疫苗型疾病的发生。而B群脑膜炎球菌荚膜多糖，由于其包含了与人类抗压潜在交叉免疫的表位，致使其免疫原性很弱，且能诱发自身免疫疾病，因此，以B群Nm荚膜多糖为免疫原的疫苗研究遇到了严重挑战。目前国际上针对B群Nm疫苗的研究主要采用二种策略，一种是基于外膜蛋白的外膜囊泡（OuterMenbraneVesicleOMV）疫苗，即针对某些特定流行菌株的克隆群；另一种是基于反向疫苗学技术的重组蛋白疫苗。上世纪70年代，美国Zollinger、Frasch等首先报道了B群脑膜炎球菌外膜囊泡（OMV）疫苗的研究，随后分别有三种代表性OMV疫苗问世。1986年，巴西、古巴等南美国家B群流脑开始流行，基于古巴流行B群脑膜炎球菌Cu385/83菌株（B4：P1.19，15），古巴Finlay研究所研制出VA-ENGOC-BC疫苗，含B群OMV、C群CPS（荚膜多糖）、AL（OH）3佐剂。1989年获得生产许可，1991年纳入免疫规划，已累计接种5500万剂次。1991年，挪威公共卫生研究所（NorwegianInstituteofPublicHealth，NIPH）采用流行的B群脑膜炎球菌44/76-SL（B15：P1.7,16）为疫苗株，研制出MenBvacTMB群OMV疫苗，后转让给凯龙（Chiron）公司，并开始研制及规模化生产。1991年，新西兰出现B群流脑流行，并基于2004-2008年间爆发疾病分离株NZ98/254（CC41/44，B4：P1.7-2.4）研制出B群脑膜炎球菌疫苗MeNZB。2000年，反向疫苗学技术在B群脑膜炎球菌疫苗上首次应用成功。该技术主要通过基因重组表达技术，分别克隆表达出fHbp、NadA和NHBA三种蛋白作为B群Nm蛋白疫苗的候选成分。目前国际上已有两种通过反向疫苗学技术研发的B群流脑蛋白疫苗，分别是诺华公司的4CMenB（Bexsero）和辉瑞公司的bivalentfHBp（r-fHBp）。4CMenB（Bexsero）含有FHbp1型蛋白、NadA蛋白和NHBA蛋白，之后又加入新西兰B群OMV疫苗（MeNZB）。BivalentfHBp（r-fHBp）是含有fHbp1型和3型的双价蛋白疫苗。另外，惠氏公司的rLP2086疫苗，含有单一脂蛋白（rLP2086）的两种重组的脂蛋白LP2086，即两种fHBp重组脂蛋白SubfamilyAvariantA05和SubfamilyBvariant01，也是4CMenB的一个组分，试验结果同样显示出能诱导出杀菌抗体。其他的报道，例如Bruge等曾将纯化B群Nm荚膜多糖中的乙酰基团用丙酰基团取代，再与载体蛋白结合而制备多糖-蛋白结合疫苗，尽管试验证明该疫苗安全性良好，但诱导的抗体无功能活性。尽管B群脑膜炎球菌疫苗研发历史久远，且已有多个上市或在研产品，仍然存在问题亟待解决。1、目前尚无国际通用的B群脑膜炎球菌OMV疫苗由于不同国家、地区B群流脑流行血清型别、亚型具有明显的地域特征，至今为止开发的OMV疫苗不具有通用性。因而，对于B群流脑OMV疫苗的研发，选择适合本地区疾病发病特征的菌株尤为重要。欧洲地区B群Nm以ST-41/44clonalcomplex（CC.克隆群）血清型15型为主，美洲和大洋洲B群Nm以ST-8CC、ST-11CC和ST-32CC血清型4型为主。我国流脑监测和Nm分子流行病学研究发现，我国B群流行菌型与国外B群流行型别不同，主要以ST-4821CC血清型3型为主，并在健康人群中大量定植。古巴、挪威、新西兰等国根据本国主要流行的B群流脑优势致病株作为疫苗株“定制”的B群NmOMV疫苗，所用菌株如下：古巴：VA-MENGOC-BC®疫苗株：Cu385/83（PorA：P1.19，15，PorB：血清型4型）；挪威：MenBvacTM疫苗株：44/76-SL（PorA：P1.17，16，PorB：血清型15型）；新西兰：MenZB疫苗株：NZ98/254（PorA：P1.7-2.4，PorB：血清型4型）。GSK受让古巴VA-MENGOC-BC®疫苗技术，并将该疫苗推广至其他国家，在不同地区的临床研究保护率各有不同。在1987-1989年，Sierra报道在古巴对106000名10-14岁学生接种2针（间隔6-8周）其保护率为83%；在1989-1990年，Moraes报道在圣保罗进行的于24-47月龄儿童中保护率为47%；在47月龄以上儿童中的保护率为74%；1990-1991年，Moronha报道在里约热内卢进行的多个在47月龄以上儿童中的临床研究显示器保护率为58-74%。1992年在巴西进行的流行病学效果观察，其对4岁以上人群的保护率为74%，而对2岁以下人群无保护性，由此有学者提出该疫苗对4岁以下儿童缺乏保护作用。该疫苗自1989年被批准使用以来，在古巴、巴西、哥伦比亚、乌拉圭等美洲国家的使用，成功控制了流脑流行，尤其重要的是其中的一些流脑爆发是由不同的B群菌株引起的。由CassiodeMoraes开展的实验得出的结论是“这一发现提示，该疫苗能够提供针对一部分B群脑膜炎球菌感染的保护作用，而不仅仅是疫苗型菌株”。自1991年起，VA-MENGOC-BC®被列入部分古巴婴幼儿疫苗接种规划中。争论的焦点—对4岁以下人群保护作用低的假说，包括伦敦皇家医学院的许多学者、专家论证认为，VA-MENGOC-BC®即使用于婴幼儿接种也能引起适当的免疫应答。VA-MENGOC-BC®是多年来唯一获得批准的B群脑膜炎球菌OMV疫苗，并在主要为拉丁美洲和加勒比海地区的15个国家共接种了约5500万剂，被证明是全球第一个安全、有效的商业化疫苗。随后各国研究的各自“定制”的OMV疫苗，也从中获得了重要经验。但至今仍没有一个国际通用的B群脑膜炎球菌OMV疫苗。2、OMV疫苗的保护覆盖范围的局限性B群脑膜炎球菌根据其PorA和PorB的蛋白分型相当复杂，血清型、亚型间彼此交叉保护性低，因此，有限价数的“定制”疫苗的保护覆盖范围有限。B群脑膜炎球菌OMV中的PorA被确定是一个主要的免疫应答诱导物，并且是血清杀菌抗体的靶点本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定点突变的蛋白，其特征在于，其中所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白中的一种或两种以上突变蛋白，所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白Subfamily A中variant2、3、Subfamily B中variant 1，所述蛋白上至少1个位点的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:1的序列的第2-10位氨基酸；所述非天然氨基酸为/n

【技术特征摘要】
1.一种定点突变的蛋白，其特征在于，其中所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白中的一种或两种以上突变蛋白，所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白SubfamilyA中variant2、3、SubfamilyB中variant1，所述蛋白上至少1个位点的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述突变位点选自：示于SEQIDNO:1的序列的第2-10位氨基酸；所述非天然氨基酸为

。


2.一种定点突变的蛋白，其特征在于，其中所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白中的一种或两种以上突变蛋白，所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白SubfamilyA中variant2、3、SubfamilyB中variant1，所述蛋白上至少1个位点的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述突变位点选自：示于SEQIDNO:2的序列的第2-10位氨基酸；所述非天然氨基酸为

。


3.一种定点突变的蛋白，其特征在于，其中所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白中的一种或两种以上突变蛋白，所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白SubfamilyA中variant2、3、SubfamilyB中variant1，所述蛋白上至少1个位点的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述突变位点选自：示于SEQIDNO:3的序列的第2-10位氨基酸；所述非天然氨基酸为

。


4.权利要求1-3任意一项所述的定点突变的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列的第N位氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸的连接方式如下式所示：

,
其中，所述的N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸。


5.一种定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的偶联物，其特征在于，所述的偶联物为权利要求1-4任意一项所述的定点突变的蛋白进一步与修饰化合物偶联，所述修饰化合物为TLR2受体激动剂。


6.如权利要求5所述的偶联物，其特征在于，所述激动剂为选自三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A、二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或其类似物。


7.如权利要求5所述的偶联物，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列的第N位氨基酸被突变修饰为如下结构：

，或者，



其中，
N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸，
n=1~20，R2为TLR2受体激动剂。


8.如权利要求7所述的偶联物，其特征在于，所述的R2为三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A、二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或其类似物。


9.如权利要求8所述的偶联物，其特征在于，所述的R2为三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物，选自如下结构式的类似物：

、或,其中n，m=1~6。


10.如权利要求8所述的偶联物，其特征在于，所述的R2为单磷酰脂质A受体激动剂衍生物。


11.如权利要求10所述的偶联物，其特征在于，所述单磷酰脂质A受体激动剂，结构式如下：



n=1~20，R端可与定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白偶联，
其中，R3选自磷酸根或H；
R4选自，n为1,3,5；或；
R8选自H或OH；
R5选自；
R6选自H或；
R7选自或。


12.如权利要求5-11任意一项所述的偶联物，其特征在于，其中所述偶联物中B群脑膜炎球菌fHBP蛋白：修饰化合物的摩尔比为1:1-30。


13.如权利要求5-11任意一项所述的偶联物，其特征在于，所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点为SEQIDNO:1中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸。


14.如权利要求5-11任意一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩猛，严志红，晏巧玲，邵娟，史建明，隋秀文，李军强，朱涛，
申请(专利权)人：康希诺生物股份公司，
类型：发明
国别省市：天津;12