绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用技术

本发明专利技术公开了一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其包括如下步骤：S1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；S2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。其运用多个免疫亲和柱对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱，再通过该目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱对绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，以提高纯化效率和效果。

【技术实现步骤摘要】
绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用
本专利技术涉及生物
，具体为一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用。
技术介绍
蛋白质的结构、功能等性质研究需要获得大量高纯度蛋白。其中，异源表达重组蛋白并进行目的蛋白的纯化是获得大量高纯度蛋白的常用方法。荧光蛋白作为融合蛋白标签，不仅在抗体制备中可以提高蛋白的免疫原性，而且通过观察细胞裂解液颜色就可以判断重组蛋白是否表达。由于亲和层析操作简单、纯化效果好，成为最常用的重组蛋白纯化方法。不同的融合标签有不同的纯化方法。如，组氨酸标签(6×his)融合蛋白可通过金属离子螯合亲和层析进行纯化；GST融合蛋白可通过酶与底物结合的专一性进行亲和纯化；MBP融合蛋白通过麦芽糖结合蛋白与麦芽糖的特异结合进行亲和纯化。但对于绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)目前还没有合适的纯化方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用，其运用多个免疫亲和柱对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱，再通过该目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱对绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，以提高纯化效率和效果。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：提供了一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其包括如下步骤：S1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；S2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。优选的，所述步骤S1中包括：S11、诱导绿色荧光蛋白表达，并对绿色荧光蛋白进行纯化；S12、建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株，注射至实验动物体内后收集腹水，且在纯化腹水后获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。优选的，所述步骤S11包括：S111、将表达载体转入宿主细胞内，通过化学方法和/或物理方法诱导绿色荧光蛋白表达；S112、对诱导表达的绿色荧光蛋白进行纯化。优选的，所述步骤S12包括：S121、选取实验动物，且将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫，且在完成动物免疫后取实验动物脾组织；S122、用PEG将实验动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性融合细胞株，且在对阳性融合细胞株进行亚克隆后进行筛选，待亚克隆阳性率达到100％时建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株；S123、取实验动物，且每只注射0.5ml石蜡油，7天后取绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株细胞重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只的剂量注射至注射有石蜡油的实验动物体内，注射7-14天后收集腹水；S124、腹水进行离心去杂后过ProteinG琼脂糖凝胶柱，洗脱后中和至中性，浓缩后即获得一个绿色荧光蛋白单克隆抗体；以及S125、重复步骤S121-S124，直至获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。优选的，步骤S121中，将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫的步骤包括：初免：按200μg抗原/只的剂量在实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式完全佐剂乳化；二免：初免7-10天后，按100μg抗原/只的剂量在同一实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式不完全佐剂乳化；三免：二免7-10天后，按100μg抗原/只的剂量在同一实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式不完全佐剂乳化。优选的，步骤S121中，将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫的步骤还包括：四免：三免7-10天后，按100μg抗原/只的剂量在同一实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式不完全佐剂乳化。优选的，所述步骤S2包括：S21、取ProteinG磁珠，离心后去上清，PBS缓冲液洗2-3次后再用PBS溶液重悬，再加入层析柱中；S22、待层析柱中的PBS缓冲液从底部出口流出后，在层析柱中加入0.5-1.5mg绿色荧光蛋白单克隆抗体，盖上层析柱盖子后于4℃摇床孵育过夜；S23、过夜后用PBS缓冲液对绿色荧光蛋白单克隆抗体清洗2-3次，排出PBS缓冲液后再加入DMP溶液，20-25℃下孵育25-35min；S24、排出DMP溶液后分别用0.2M三乙醇胺洗2-3次、50mM乙醇胺洗1-2次、1M甘氨酸溶液洗1-2次，以去除游离抗体；再用PBS缓冲液平衡层析柱后即获得与一个绿色荧光蛋白单克隆抗体对应的免疫亲和柱；以及S25、重复步骤S21-S24，以获得N个免疫亲和柱。优选的，所述步骤S3包括：S31、将表达绿色荧光蛋白融合蛋白的宿主细胞超声破碎，离心后保留上清液；S32、分别取10-20mL上清液过N个免疫亲和柱中的一个或几个，且每一免疫亲和柱反复过2-3次，收集流穿液；S33、PBS缓冲液洗3次，加入甘氨酸洗脱液洗脱，并收集洗脱液；以及S24、将上清液、流穿液和洗脱液分别进行SDS-PAGE电泳，根据电泳结果选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。还提供一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱，其通过上述制备方法制备获得。还提供一种上述绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱在纯化绿色荧光蛋白标签融合蛋白中的运用。与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：本专利技术运用多个免疫亲和柱对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱，再通过该目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱对绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，以得到纯化后的目的蛋白。附图说明图1为本专利技术中Ni柱亲和纯化GFP蛋白后的电泳图；图2为本专利技术中WB检测3只小鼠尾血中GFP抗体效价的结果图；图3a为本专利技术中1号GFP-his蛋白板的俯视图；图3b为本专利技术中2号GFP-his蛋白板的俯视图；图4a为本专利技术中1号his-MBPELISA板的俯视图；图4b为本专利技术中2号his-MBPELISA板的俯视图；图5a-5d为本专利技术中分别过1-12号免疫亲和柱后上清液、流穿液和洗脱液的电泳图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；/nS2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；/n以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。/n

【技术特征摘要】
1.一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；
S2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；
以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中包括：
S11、诱导绿色荧光蛋白表达，并对绿色荧光蛋白进行纯化；
S12、建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株，注射至实验动物体内后收集腹水，且在纯化腹水后获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。


3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S11包括：S111、将表达载体转入宿主细胞内，通过化学方法和/或物理方法诱导绿色荧光蛋白表达；S112、对诱导表达的绿色荧光蛋白进行纯化。


4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S12包括：S121、选取实验动物，且将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫，且在完成动物免疫后取实验动物脾组织；
S122、用PEG将实验动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性融合细胞株，且在对阳性融合细胞株进行亚克隆后进行筛选，待亚克隆阳性率达到100％时建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株；
S123、取实验动物，且每只注射0.5ml石蜡油，7天后取绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株细胞重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只的剂量注射至注射有石蜡油的实验动物体内，注射7-14天后收集腹水；
S124、腹水进行离心去杂后过ProteinG琼脂糖凝胶柱，洗脱后中和至中性，浓缩后即获得一个绿色荧光蛋白单克隆抗体；
以及S125、重复步骤S121-S124，直至获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。


5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S121中，将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫的步骤包括：
初免：按200μg抗原/只的剂量在实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式完全佐剂乳化；
二免：初免7-10天后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：方卫斌，张海灵，
申请(专利权)人：天德瑞北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11