一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于病毒检测的生物技术领域，具体涉及一种用于新冠肺炎病毒SARS‑CoV‑2核酸检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系；所述检测方法包括如下步骤：a）制备新冠病毒核酸样品；b）取步骤a）得到的核酸样品，利用病毒核酸orf1a、orf1a、N和E基因片段的特异性引物，加入RT‑RPA等温扩增体系，扩增获得特异性产物；c）将步骤b）得到的特异性产物加入Cpf1检测体系，反应得到Cpf1检测产物；d）将Cpf1检测产物进行胶体金试纸条检测。本发明专利技术通过利用Cpf1特异识别核酸和胶体金试纸条检测技术，实现对新冠病毒核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于病毒检测的生物
，具体涉及一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2)。世界卫生组织(WHO)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19，该病毒与严重的急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)相似。SARS-CoV-2(ssRNA+)是具包膜RNA冠状病毒(sarbecovirus亚属，Orthocoronavirinae亚科)的第七个成员。目前，对于新冠肺炎的诊断主要有病毒核酸分子检测和胸部影像学检测两种。胸部影像学检测，主要依赖于胸肺部CT成像结果进行判断：早期呈现多发的小斑片影及间质改变，以肺外带明显，进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影。严重者出现肺实变，甚至‘白肺’，胸腔积液少见。但是，胸肺部CT检测，需要依赖于专业。在分子生物学的手段上，目前常用的办法有两种：病毒的基因测序和核酸检测。二代测序因为可以检测微量物质，但是大多数医院没有测序的设备和生物信息团队来协助，并且成本高检测周期也比较长，不适合做筛查。现在的诊断方法以来病毒核酸检测：通过实时反转录聚合酶链式反应(realtimereversetranscritionPCR，rRT-PCR)鉴定。每个病例采集上、下呼吸道标本，如支气管和肺泡灌洗液、深咳痰液，同时采集发病初期和发病14天后的血清。目前在符合疑似病例标准的基础上，对痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本进行rRT-PCR检测，显示SARS-CoV-2核酸阳性，即可确诊SARS-CoV-2感染。rRT-PCR检测病毒核酸主要受制于：试剂盒质量和能够承担临床检测的P3实验室数量、P3实验室设备的准确性和稳定性、能进行熟练稳定操作的工作人员人数、需要一些昂贵的实验设备、并且检测时间较长。目前，尚没有针对SARS-CoV-2感染有效治疗手段或疫苗，疾病控制主要依赖于严格的物理隔离切断传播途径，从而直接造成严重的经济损失，鉴于SARS-CoV-2传播途径广泛和传播速度快，迫切需要病毒的快速诊断，这对于预防和确诊该病非常重要。实现SARS-CoV-2准确快速的检测，使得防疫检疫决策可以当机立断、立即处置，达到阻断扩散风险的目的。CRISPR-Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPRRNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)，当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物。胶体金检测作用时间短、在广泛的气候条件下长期稳定以及相对低成本，这些特性使其广泛适用于未经训练的人员进行临床一线使用。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法，利用Cpf1特异性和高灵敏识别切割靶核酸，结合胶体金试纸条进行目视判读检测结果，实现对SARS-CoV-2核酸快速检测。本专利技术的
技术实现思路
如下：本专利技术提供了一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒，所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系；所述基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系包括针对新冠病毒SARS-CoV-2核酸的特异性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统；所述特异性crRNA包括针对orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2，针对orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2，针对N基因的N-cr1到N-cr2和针对E基因的E-cr1到E-cr2中的任意一种或多种，其基因序列分别为SEQNO.1到SEQNO.8；根据基因生物信息学分析，将SARS-CoV-2病毒序列与NVBI数据库中SARS和bat-relatedSARS病毒序列，设计针对orf1a、orf1b、N和E基因片段的特异性crRNA，为保证检测特异性，对设计的crRNA序列检索NCBI核酸数据库中包括人、动物、植物和微生物等基因，确定没有高同源性匹配；根据Cpf1识别特定PAM序列特点，在orf1a、orf1b、N和E基因靶序列上设计8条特异性crRNA，通过检测发现8个crRNA分别能特异性识别SARS-CoV-2病毒orf1a、orf1b、N和E的4个基因，并且，针对同一待检样品，同时对SARS-CoV-2病毒4基因orf1a、orf1b、N和E的检测，能有效提高检测准确性和可信性；所述ssDNA报告系统为采用包括地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物为/5Dig/TTTATTA/3Bio/，命名为ssDNADBreporter/5Dig/TTTATTA/3Bio/，用于胶体金试纸条检测；所述胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；所述PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线；所述特异性crRNA的制备方法包括如下步骤：针对SARS-CoV-2病毒基因片段orf1a、orf1b、N和E，找到包含Cpf1识别序列TTTN的靶向序列，设计23bp长度的crRNA，通过体外转录或者合成获得特异性crRNA；所述Cpf1蛋白的制备方法包括如下步骤：针对Cpf1蛋白进行原核密码子优化获得序列SEQNO.13，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白；本专利技术的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测原理为：若Cpf1检测体系中存在SARS-CoV-2病毒核酸，会由在SARS-CoV-2特异性crRNA介导下特异性激活Cpf1蛋白的核酸内切酶活性，从而切割ssDNADBreporter，得到的切割反应产物加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的鼠抗地高辛抗体会与地高辛标记的ssDNA报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系。


2.由权利要求1所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述基于Cpf1的胶体金试纸条检测体系包括针对新冠病毒SARS-CoV-2核酸的特异性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统。


3.由权利要求2所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述特异性crRNA包括针对orf1a基因的orf1a-cr1到orf1a-cr2，针对orf1b基因的orf1b-cr1到orf1b-cr2，针对N基因的N-cr1到N-cr2和针对E基因的E-cr1到E-cr2中的任意一种或多种，其基因序列分别为SEQNO.1到SEQNO.8。


4.由权利要求2所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA报告系统为采用包括地高辛和生物素标记的ssDNA，用于胶体金试纸条检测。


5.由权利要求2或3所述的用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述特异性crR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，王鑫杰，钟名天，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：广东;44