本发明专利技术提供一种用于检测细菌中NDM‑1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体8E3的酶标板、检测抗体4G7‑HRP、NDM‑1蛋白标准品。本发明专利技术选用8E3作为捕获抗体，4G7‑HRP作为检测抗体研制了NDM‑1双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为NDM‑1阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。
【技术实现步骤摘要】
一种检测NDM-1耐药蛋白双抗夹心ELISA试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于免疫学分析
技术介绍
近年来，由于抗生素在临床大量使用甚至不当使用，在抗生素的选择压力下，临床疾病相关细菌的耐药菌株不断出现，而且出现多重耐药株，由于耐药菌可进行多途径高速率传播，尤其是人畜的交叉感染，严重威胁了人类的生命安全，同时大大增加了临床抗感染的难度。NDM-1又名“新德里金属-β-内酰胺酶1”，简称为NDM-1。新德里金属β内酰胺酶-1(NDM-1)属于B1亚类金属β内酰胺酶，能水解除氨曲南外的绝大多数β内酰胺类抗菌药物，其基因大多定位在质粒上，易引起水平传播。2010年Kumarasamy等报道了产NDM-1肠杆菌在印度、巴基斯坦以及英国等国家的流行，引起国际性的关注。随后，美国、德国、日本、中国香港等地不断检出携带NDM-1的菌株，多为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌等临床常见的致病菌。据报道，这种病可以通过饮水等途径传染，表现症状为肠道感染，这种新型细菌对几乎所有抗生素都具有抗药性，死亡率很高，不仅在医院中存在，在自然界中也同样存在。目前现有检测NDM-1的方法主要有纸片扩散法、Etest检测法、微量稀释法、PCR等。其中，纸片扩散法缺乏特异性，仅适合初筛试验，Etest检测法、微量稀释法灵敏度低，而PCR可通过特异性引物对NDM-1阳性细菌进行确证，但对仪器设备的要求较高，且操作复杂，不易在临床应用，而ELISA作为常用的检测微生物的方法，具有快速、灵敏、高通量、特异性好等特点，因此建立一种用于检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA试剂盒及方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速的检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒及检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体8E3的酶标板、检测抗体4G7-HRP、NDM-1蛋白。在一个实施方案中，所述检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：1）重组NDM-1(36-270)蛋白为通过截断NDM-1序列，N端添加HIS标签，克隆至表达载体pET-28a，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的；上述重组NDM-1（36-270）蛋白氨基酸序列为序列1；在一个实施方案中，所述NDM-1单克隆抗体8E3，4G7为采用重组NDM-1（36-270）蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的；所述单克隆抗体8E3的重链可变区的氨基酸序列为序列2；所述单克隆抗体8E3的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；所述单克隆抗体4G7的重链可变区的氨基酸序列为序列4；所述单克隆抗体4G7的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。在一个实施方案中，所述检测抗体4G7-HRP的制备方法包括如下步骤：（1）称取5mgHRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20mL新配的0.1MNaIO4溶液，4℃避光搅拌25min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1M，pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000r/min，4℃，离心10min，去除沉淀，得到透析后的HRP；（2）将单克隆抗体4G7用0.2M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；（3）将透析后的HRP加入0.16M乙二醇（每mg酶加0.1mL），4℃避光搅拌1h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；（4）对0.15MpH7.4PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3h；4℃，10000rpm离心15min，弃上清；PBS溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶标记的检测抗体HRP-4G7。在一个实施方案中，所述检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，还包括如下步骤：1）包被有单克隆抗体8E3的酶标板的制备：将单克隆抗体8E3用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释成浓度为5μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜后洗板；然后每孔加入100μL2%BSA（含0.3%NaN3），37℃，湿度30-40%封闭2h，然后37℃，湿度30-40%恒温干燥2h；2）检测抗体稀释液：0.01MpH7.4的PBST溶液；3）检测抗体工作液的制备：检测抗体4G7-HRP按照1:30000比例稀释后备用；4）样品稀释液的制备：0.01MpH7.4的PBS溶液；5）底物A液的制备：含0.08%过氧化脲、0.025%PEG-2000、3.58%十二水合磷酸氢二钠、0.96%一水合柠檬酸钠水溶液，调pH值至7.4；6）底物B液的制备：含1.03%一水合柠檬酸钠、0.04%TMB、0.0008%硫代硫酸钠、0.1%光稳定剂292、3%DMF水溶液，调pH值至5.0。本专利技术的第二个目的在于提供一种NDM-1蛋白双抗夹心ELISA检测方法，该方法操作简便，检测快速，特异性强，灵敏度高。具体的说，一种细菌中NDM-1蛋白双抗夹心ELISA检测法，采用以下步骤：（1）以pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲溶液包被捕获抗体8E3(5μg/mL)，酶标板中每孔加入100μL，4℃过夜，使其与酶标板紧密结合；（2）次日，弃去孔内溶液，用洗涤液(PBST)洗板3次，每次3min；每孔加入100μL2%BSA（含0.3%NaN3）进行封闭，37℃温育2h；封闭结束后向酶标板孔内加入细菌裂解液，并同时设置阴性对照孔（0.01MPB，pH7.4）和阳性对照孔（NDM-1蛋白，2ng/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；（3）弃去孔内溶液，洗板3次后，加入检测抗体4G7-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h；（4）弃去孔内溶液，洗板3次，最后加入的显色剂TMB溶液（现用现配），每孔100μL，37℃孵育10min。在HRP作用下，显色剂发生颜色变化，加入终止液（2MH2SO4）50μL/孔；（5）测定：用酶标仪检测OD450nm。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包括终止液、封闭液和洗涤液；具体的所述终止液为2mol/L硫酸；所述封闭液为2%BSA（含0.3%NaN3）；所述洗涤液为含0.1%Tween-20的0.01MpH7.4PBST溶液。所述NDM-1蛋白阳性对照为NDM-1（36-270），浓度为2ng/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术制备了NDM-1单克隆抗体，并建立了细菌中NDM-1蛋白的双抗夹心ELISA方法，该方法检测NDM-1（36-270）蛋白LOD为0.5ng/mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体8E3的酶标板、检测抗体4G7-HRP、NDM-1蛋白标准品。/n
【技术特征摘要】
20200316 CN 202010180297X1.一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体8E3的酶标板、检测抗体4G7-HRP、NDM-1蛋白标准品。
2.根据权利要求1所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述单克隆抗体8E3和检测抗体4G7为采用重组NDM-1蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的。
3.根据权利要求1或2所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述单克隆抗体8E3的重链可变区的氨基酸序列为序列2；
所述单克隆抗体8E3的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；
所述单克隆抗体4G7的重链可变区的氨基酸序列为序列4；
所述单克隆抗体4G7的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。
4.根据权利要求2所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
重组NDM-1(36-270)蛋白为通过截断NDM-1序列目的片段，N端添加His-tag标签，克隆至表达载体pET-28a，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的。
5.根据权利要求4所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组NDM-1(36-270)蛋白氨基酸序列为序列1。
6.根据权利要求1所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体4G7-HRP的制备方法如下：
（1）称取5mgHRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20mL新配的0.1MNaIO4溶液，4℃避光搅拌25min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1M，pH为4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000r/min，4℃，离心10min，去除沉淀；得到透析后的HRP；
（2）将单克隆抗体4G7用0.2M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；
（3）将透析后的HRP加入0.16M乙二醇（每mg酶加0.1mL），4℃避光搅拌1h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；
（4）对0.15MpH7.4PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3h；4℃，10000rpm离心15min，弃上清...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，王程玉，邱增枝，
申请(专利权)人：北京明日达科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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