一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于区分新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS‑CoV)以及四种常见的人冠状病毒(包括人冠状病毒229E(HCoV‑229E)、人冠状病毒NL63(HCoV‑NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV‑HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV‑OC43))的多重反转录实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)试剂盒、专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管四色荧光多重RT‑qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分冠状病毒。本发明专利技术的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。

【技术实现步骤摘要】
一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法。
技术介绍
人感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)后的常见体征包括呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难，在重症病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭甚至死亡，截止目前尚无特异性治疗方法，早发现早隔离是最为有效的遏制病毒传播的措施。由于针对不同冠状病毒感染患者的诊疗方式存在本质区别，对普通冠状病毒感染区分并进行分流治疗，有助于集中医疗资源对SARS-CoV-2阳性患者的针对性治疗，有助于提升治愈率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服
技术介绍
的技术缺陷，提供一种用于区分SARS-CoV-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)以及四种常见的人冠状病毒(包括人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43))的多重反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分冠状病毒。本专利技术的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术所提供的一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒包含RT-qPCR反应液(包含引物探针组合物)、RT-qPCR酶液、阳性对照以及阴性对照。其中RT-qPCR反应液包括反应所需的dNTPs、dUTP、Mg2+、缓冲液(表1)和引物探针组合物(表2和表3)。表1RT-qPCR反应液试剂组成(50人份)其中引物探针组合物包含用于检测SARS-CoV-2S基因，SARS-CoV-2和SARSN基因，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43ORF1ab基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和探针，引物和探针序列信息如表2所示，引物和探针组成如表3所示。由上述正反向引物和探针序列的衍生序列也属于本
技术实现思路
，所述衍生序列是指在SEQIDNO：1～21的基础上，在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。表2RT-qPCR反应液中所包含的引物和探针序列信息其中，SARS-CoV-2S基因扩增产物长度为128bp；SARS-CoV-2N基因和SARSN基因扩增产物长度为102bp；HCoV-229EORF1ab基因扩增产物长度为105bp；HCoV-HKU1ORF1ab基因扩增产物长度为92bp；HCoV-NL63ORF1ab基因扩增产物长度为114bp；HCoV-OC43ORF1ab基因扩增产物长度为114bp；人类RNA内参B2M基因扩增产物长度为147bp。表3用于冠状病毒分型检测的引物和探针组成(50人份)其中RT-qPCR酶液中包含逆转录酶、热启动DNA聚合酶和UNG酶，其组分配比详见表4。表4RT-qPCR酶液各组分配比(50人份)冠状病毒多重RT-qPCR分型检测试剂盒中阳性对照为包含SARS-CoV-2S基因、SARS-CoV-2N基因、HCoV-229EORF1ab基因、HCoV-NL63ORF1ab基因、HCoV-HKU1ORF1ab基因、HCoV-OC43ORF1ab基因和人类RNA内参B2M基因序列的重组质粒，阴性对照为RNase-freeH2O。进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对疑似患者呼吸道样本进行RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重RT-qPCR扩增，并对得到的扩增曲线进行分析，最终做出阴阳性判断。具体使用方法包括以下步骤：(1)采用核酸自动提取仪对样本总核酸进行提取；(2)取提取得到的核酸，按照表5配制多重RT-qPCR反应体系；表5多重RT-qPCR反应体系RT-qPCR反应体系加样量(杜L)RT-qPCR反应液14RT-qPCR酶液1待检测的核酸样本/阴阳对照品5总体积20(3)根据表6设定反应程序进行多重RT-qPCR反应；表6多重RT-qPCR反应程序(4)根据多重RT-qPCR扩增曲线进行阴阳性判断，阴性结果判断条件：VIC通道的Ct值≤38，且其他荧光信号通道的Ct值≥38或显示为Undetermined/NoCt；阳性结果判定条件：若FAM通道/ROX通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，Cy5通道Ct值≥38或显示为Undetermined/NoCt，则样本判断为SARS-CoV-2阳性；若ROX通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，Cy5通道/FAM通道Ct值≥38或显示为Undetermined/NoCt，则样本判断为疑似SARS-CoV-2或SARS阳性，需做进一步筛查；若Cy5通道/VIC通道Ct值≤38，且扩增曲线呈典型S型，FAM通道/ROX通道Ct值≥38或显示为Undetermined/NoCt，则样本判断为HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HUK1、HCoV-OC43中的一种冠状病毒阳性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术目的在于提供一种用于区分SARS-CoV-2、SARS-CoV以及四种常见的人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43)的多重RT-qPCR试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分冠状病毒。本专利技术的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。附图说明图1为SARS-CoV-2S基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5为1×102拷贝的阳性重组质粒；图2为SARS-CoV-2N基因RT-qPCR灵敏度检测结果，其中1为1×106拷贝的阳性重组质粒；2为1×105拷贝的阳性重组质粒；3为1×104拷贝的阳性重组质粒；4为1×103拷贝的阳性重组质粒；5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于冠状病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括分别用于检测SARS-CoV-2 S基因、SARS-CoV-2 N基因、SARS N基因、HCoV-229E ORF1ab基因、HCoV-NL63 ORF1ab基因、HCoV-HKU1 ORF1ab基因、HCoV-OC43 ORF1ab基因、HCoV-NL63ORF1ab基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和相应探针；/n所述用于检测SARS-CoV-2 S基因的正向引物序列为5’-GGCCATGGTACATTTGGCT-3’，如SEQ ID NO：1所示，其反向引物序列为5’-GCAGCAGGATCCACAAGAA-3’，如SEQ ID NO：2所示，其探针序列为5’-TTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTG-3’，如SEQ ID NO：3所示；/n所述用于检测SARS-CoV-2 N基因和SARS N基因的正向引物列为5’-CTGAGGGAGCCTTGAATACA-3’，如SEQ ID NO：4所示，其反向引物序列为5’-TTGGCAATGTTGTTCCTTGA-3’，如SEQ ID NO：5所示，其探针序列为5’-AACAATGCTGCMAYCGTGCTAC-3’，如SEQ ID NO：6所示；/n所述用于检测HCoV-229E ORF1ab基因的正向引物序列为5’-ACTTTGTCAGTTCGTATGCTAAAC-3’，如SEQ ID NO：7所示，其反向引物序列为5’-TTGTCAGAACATTGGCATTAACA-3’，如SEQ ID NO：8所示，其探针序列为5’-ATTATCAGCTTATGACTTGGCGTGT-3’，如SEQ ID NO：9所示；/n所述用于检测HCoV-NL63 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-GTTCTCTTATAGGTGGCATGGT-3’，如SEQ ID NO：10所示，其反向引物序列为5’-GAAGCACATCAGTTTGTAAAGCA-3’，如SEQ ID NO：11所示，其探针序列为5’-CCTTTTTCTTTGGCACTGCAAGCAC-3’，如SEQ ID NO：12所示；/n所述用于检测HCoV-HKU1 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-AGTTTATCTTTAGTTGATGTTTGGGA-3’，如SEQ ID NO：13所示，其反向引物序列为5’-GATTTAACTAGGCGTGACAATTCAT-3’，如SEQ ID NO：14所示，其探针序列为5’-TATTTGACAGGTTGTGATTATGTTGTTTGGG-3’，如SEQ ID NO：15所示；/n所述用于检测HCoV-OC43 ORF1ab基因的正向引物序列为5’-CTGGCCACTAGTTATTATTGCAAA-3’，如SEQ ID NO：16所示，其反向引物序列为5’-TCTGGACCACTATTAACAACCTG-3’，如SEQ ID NO：17所示，其探针序列为5’-TTGCAAAATAATGAATTAATGCCTGCTAAGTTGA-3’，如SEQ ID NO：18所示；/n所述用于检测人类RNA内参B2M基因的正向引物序列为5’-TCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’，如SEQ ID NO：19所示，其反向引物序列为5’-CCACTTTTTCAATTCTCTCTCCATT-3’，如SEQ IDNO：20所示，其探针序列为5’-TCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTG-3’，如SEQ ID NO：21所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于冠状病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括分别用于检测SARS-CoV-2S基因、SARS-CoV-2N基因、SARSN基因、HCoV-229EORF1ab基因、HCoV-NL63ORF1ab基因、HCoV-HKU1ORF1ab基因、HCoV-OC43ORF1ab基因、HCoV-NL63ORF1ab基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和相应探针；
所述用于检测SARS-CoV-2S基因的正向引物序列为5’-GGCCATGGTACATTTGGCT-3’，如SEQIDNO：1所示，其反向引物序列为5’-GCAGCAGGATCCACAAGAA-3’，如SEQIDNO：2所示，其探针序列为5’-TTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTG-3’，如SEQIDNO：3所示；
所述用于检测SARS-CoV-2N基因和SARSN基因的正向引物列为5’-CTGAGGGAGCCTTGAATACA-3’，如SEQIDNO：4所示，其反向引物序列为5’-TTGGCAATGTTGTTCCTTGA-3’，如SEQIDNO：5所示，其探针序列为5’-AACAATGCTGCMAYCGTGCTAC-3’，如SEQIDNO：6所示；
所述用于检测HCoV-229EORF1ab基因的正向引物序列为5’-ACTTTGTCAGTTCGTATGCTAAAC-3’，如SEQIDNO：7所示，其反向引物序列为5’-TTGTCAGAACATTGGCATTAACA-3’，如SEQIDNO：8所示，其探针序列为5’-ATTATCAGCTTATGACTTGGCGTGT-3’，如SEQIDNO：9所示；
所述用于检测HCoV-NL63ORF1ab基因的正向引物序列为5’-GTTCTCTTATAGGTGGCATGGT-3’，如SEQIDNO：10所示，其反向引物序列为5’-GAAGCACATCAGTTTGTAAAGCA-3’，如SEQIDNO：11所示，其探针序列为5’-CCTTTTTCTTTGGCACTGCAAGCAC-3’，如SEQIDNO：12所示；
所述用于检测HCoV-HKU1ORF1ab基因的正向引物序列为5’-AGTTTATCTTTAGTTGATGTTTGGGA-3’，如SEQIDNO：13所示，其反向引物序列为5’-GATTTAACTAGGCGTGACAATTCAT-3’，如SEQIDNO：14所示，其探针序列为5’-TATTTGACAGGTTGTGATTATGTTGTTTGGG-3’，如SEQIDNO：15所示；
所述用于检测HCoV-OC43ORF1ab基因的正向引物序列为5’-CTGGCCACTAGTTATTATTGCAAA-3’，如SEQIDNO：16所示，其反向引物序列为5’-TCTGGACCACTATTAACAACCTG-3’，如SEQIDNO：17所示，其探针序列为5’-TTGCAAAATAATGAATTAATGCCTGCTAAGTTGA-3’，如SEQIDNO：18所示；
所述用于检测人类RNA内参B2M基因的正向引物序列为5’-TCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’，如SEQIDNO：19所示，其反向引物序列为5’-CCACTTTTTCAATTCTCTCTCCATT-3’，如SEQIDNO：20所示，其探针序列为5’-TCTGCTGGATGACGTGAGTAAACCTG-3’，如SEQIDNO：21所示。


2.如权利要求1所述的一种用于冠状病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，所述用于检测SARS-CoV-2S基因的探针5’端添加荧光报告基团FAM，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；所述用于检测SARS-CoV-2N基因和SARSN基因的探针5’端添加荧光报告基团ROX，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；所述用于检测HCoV-229EOR...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志山，李贵霞，张迪骏，王乐，赵梦川，郭映辉，帖彦清，段素霞，吴勇，
申请(专利权)人：河北省儿童医院，河北省人民医院，宁波海尔施基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13