一种等位特异性位点编辑方法技术

本发明专利技术涉及一种等位特异性位点编辑方法，包括以下步骤：1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；2)对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；3)待胚胎大约发育到受精卵PN3‑4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核，再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。本发明专利技术实现了Cas9活性控制及单等位位点编辑，扩大了基因编辑的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种等位特异性位点编辑方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种基因编辑方法，具体地说，是一种等位特异性位点编辑方法。
技术介绍
CRISPR-Cas9基因敲除系统的建立大大简化了基因编辑的操作流程并具有很高的效率，它对生物技术、医学等领域的发展产生了深远的影响。CRISPR-Cas9在sgRNA的引导下能够在体内或者体外条件下特异性的识别基因组序列并且诱导双链断裂(DSBs)。此时，主要激活了非同源末端连接(NHEJ)的修复通路，在断裂位点处随机的引入小片段的插入或者缺失导致编码序列的移码突变。利用NHEJ的相对较高的修复效率这一优势，在受精卵中共注射Cas9mRNA和靶向目的基因的sgRNA可以有效的产生基因编辑的模式动物。然而，由于Cas9一旦表达即具有持续切割的活性并且很难精确的在时间和空间的层次上控制Cas9的表达，这将会很大程度地限制Cas9对基因编辑的灵活性，因此仍然会带来许多的弊端。首先，由于持续的Cas9切割活性，通过这种方法产生的胚胎或者出生的动物绝大多数会存在基因型的嵌合结果。其次，对于二倍体生物，在传统的CRISPR-Cas9系统作用下，很难精确的对单等位位点进行编辑。因此，亲缘性等位特异性的基因组位点也不能通过传统的CRISPR-Cas9系统进行选择性的识别或者修改。这些缺陷归根结底是因不能有效的对Cas9活性进行时空特异性控制，这很大程度的限制了Cas9在基因功能性验证或者临床应用的效率。由于无法高效实现Cas9活性控制及单等位位点编辑，这极大地限制了基因编辑的应用范围。例如产生的基因敲除动物大多是嵌合体，需要进行进一步纯化，耗费大量时间；无法有效得到携带有致死基因突变的动物模型或一步获得杂合敲除动物模型；在机制研究中无法对印记基因进行有效的功能性鉴定；同时在基因治疗中也存在很大的局限性。专利文献CN109152848A，公开日20190104，公开了一种控制Cas9基因编辑活性的II-C型Cas9抗-CRISPR(Acr)抑制剂，此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。然而，该技术也并未很好地解决前述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供了一种等位特异性位点编辑的方法。第一方面，本专利技术提供了一种等位特异性位点编辑方法，包括以下步骤：1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；3)等待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核；再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。作为一个优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行体外培养到囊胚。作为另一优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。更优选地，步骤5)之后还包括步骤6)：重构胚胎或胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。作为另一优选例，步骤3)中将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中所采用的方法是基于仙台病毒蛋白的胞膜融合方法。第二方面，本专利技术提供了一种精确的实现亲缘性等位特异性基因编辑的方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。第三方面，本专利技术提供了一种减少基因型嵌合现象的基因编辑方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。第四方面，本专利技术提供了一种构建携带有胚胎致死性基因突变动物模型的方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。第五方面，本专利技术提供了一种印记基因的功能性鉴定方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。第六方面，本专利技术提供了一种基因编辑方法，包含以下步骤：1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；3)待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组每个受精卵的雌雄原核共同取出备用，将未处理组受精卵的雌雄原核取出弃掉，然后将注射组取出的雌雄原核融合到已经弃掉双原核的未处理组受精卵中；4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。作为一个优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行体外培养到囊胚。作为另一优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。更优选地，步骤5)之后还包括步骤6)：重构胚胎或胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。作为另一优选例，步骤3)中将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中所采用的方法是基于仙台病毒蛋白的胞膜融合方法。第七方面，本专利技术提供了一种构建具有一致突变位点的双等位位点敲除动物模型的方法，其包含如上任一所述基因编辑方法的步骤。本专利技术优点在于：通过显微操作的辅助方式实现核质分离以过滤掉存留在胞质中的多余Cas9并利用物理稀释的方法更加精确的控制Cas9的靶向活性，从而进一步实现单等位位点编辑，扩大了基因编辑的应用范围，例如，很大程度的降低了敲除基因型的嵌合率；可以得到携带有致死基因突变的动物模型或一步获得杂合敲除动物模型；可对印记基因进行有效的功能性鉴定，便于机制研究；能有效的用于显性突变引起的遗传病治疗，等等。本文中，所述Cas9和sgRNA的显微注射、卵母细胞的体外受精、受精卵的雌雄原核分离、仙台病毒蛋白介导的核移植、胚胎移植均为本领域熟知的技术，不存在操作上的困难。所述胚胎移植技术为非手术性胚胎移植技术，该技术在人工受孕和动物实验中均广泛应用，以小鼠非手术性胚胎移植为例，其具体操作可参见文献(段新崇,等.一种非手术性小鼠胚胎移植技术.《生物工程学报》2016年04期)等现有技术。附图说明附图1：本专利技术Past-CRISPR方法的主要操作步骤示意图。附图2：两组单等位位点突变胚胎占比。左图为Past-CRISPR处理胚胎组；右图为传统受精卵注射胚胎组。附图3：单等位位点突变胚胎的亲缘性等位特异性靶向位点与各自的SNP对比图。附图4：两组基因型嵌合胚胎占比。左图为Past-CRISPR处理胚胎组；右图为传统受精卵注射胚胎组。附图5：携带有胚胎致死本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种等位特异性位点编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；/n2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；/n3)等待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核；再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；/n4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。/n

【技术特征摘要】
1.一种等位特异性位点编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；
2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；
3)等待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核；再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；
4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。


2.根据权利要求1所述的等位特异性位点编辑方法，其特征在于，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行体外培养到囊胚。


3.根据权利要求1所述的等位特异性位点编辑方法，其特征在于，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。

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【专利技术属性】
技术研发人员：高绍荣，刘文强，李延鹤，翁雨藤，柏丹丹，陈嘉瑜，殷吉庆，
申请(专利权)人：上海市第一妇婴保健院，
类型：发明
国别省市：上海;31