一种敲除ADRB3基因的小鼠及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种敲除了ADRB3基因的小鼠及其在制备与筛选提升性能力或繁殖能力的药物、以及调节性能力的保健品中的应用；本发明专利技术还公开了敲除小鼠ADRB3基因的方法，该方法采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠ADRB3基因。采用本发明专利技术的方法制备的ADRB3敲除雄性小鼠，其生殖能力极强，生殖周期非常长，衰老速度得到明确延缓。

【技术实现步骤摘要】
一种敲除ADRB3基因的小鼠及其应用
本专利技术涉及基因敲除动物模型
，尤其是一种敲除ADRB3基因的小鼠及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要一种内切酶(endonuclease)——Cas9就足够了，我们将这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统(typeIIsystems)。Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割，其主要识别的还是保守的间隔相邻基序(proto-spaceradjacentmotifs，PAM基序)。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体，还需要另外两个RNA分子的帮助，它们就是CRISPRRNA(crRNA)和反式作用CRISPRRNA(trans-actingCRISPRRNA,tracrRNA)。crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA(single-guideRNA,sgRNA)。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称，在多种类型的细胞和生物体内，这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作。细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复，这两种方式分别是同源重组修复机制(homologousrecombination,HR)和非同源末端连接修复机制(non-homologousendjoining,NHEJ)，不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰，或者插入新的遗传信息。根据现有的文献报道，β3肾上腺素能受体(ADRB3)是G蛋白耦联受体超家族的成员之一，主要作用于脂肪组织，参与调节脂肪分解和能量代谢。本申请的专利技术人经过检索，并未发现ADRB3基因与男性的性功能有关。
技术实现思路
本申请的专利技术人在研究ADRB3的作用机制的过程中，意外地发现了敲除了ADRB3基因的小鼠在性功能方面的显著变化，进而提出，ADRB3基因敲除小鼠作为研究动物性功能的动物模型的应用，以及该动物模型用于药物和保健品开发的技术方案。具体地，本专利技术的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本专利技术提供了一种小鼠，所述小鼠敲除了ADRB3基因。本申请的专利技术人经过多次试验发现，敲除了ADRB3基因的雄鼠生殖能力极强，交配时间显著增加，生殖周期非常长，衰老明确延缓。作为上述方案的进一步优化，所述小鼠敲除了ADRB3基因的第2个外显子。作为上述方案的进一步优化，所述小鼠为C57BL/6小鼠。作为上述方案的进一步优化，所述小鼠为8周龄雄鼠。在第二个方面，本专利技术提供一种敲除小鼠ADRB3基因的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠ADRB3基因。作为上述方案的进一步优化，所述CRISPR/Cas9系统包括PD1411载体和表达sgRNA的寡核苷酸对，所述sgRNA靶向位于ADRB3基因第二个外显子首尾的两段核苷酸。其中，PD1411载体中含有能表达CAS9核酸酶的基因片段。作为上述方案的进一步优化，所述寡核苷酸对两端设有可以整合到PD1411载体中的酶切位点。作为上述方案的进一步优化，所述sgRNA的靶序列如SeqIDNO.1或SeqIDNO.2，以及SeqIDNO.3或SeqIDNO.4所示。在第三个方面，本专利技术提供一种用于研究动物性功能或繁殖能力的模型，所述模型为上述小鼠或采用上述方法制备的小鼠。在第四个方面，本专利技术提供上述小鼠或采用上述方法制备的小鼠在制备或筛选提升性能力或繁殖能力的药物、以及调节性能力的保健品中的应用。另外，本专利技术还提供了敲除ADRB3基因的试剂在制备抗衰老的药物或保健品中的应用。综上所述，本专利技术的有益效果为：采用本专利技术的方法制备的ADRB3敲除雄性小鼠，其生殖能力极强，生殖周期非常长，衰老速度得到明确延缓。附图说明图1为本专利技术中sgRNA的靶向序列所在的位置；图2为PD1411载体的环形图；图3为本专利技术中sgRNA插入PD1411载体的原理图；图4为本专利技术中CRISPR/Cas9系统敲除ADRB3的原理图；图5为本专利技术中阳性小鼠的鉴定结果图。具体实施方式本专利技术提供了敲除ADRB3(adrenergicreceptor，beta3)基因的C57BL/6小鼠，及其在研究性功能持久性与长时间繁殖优势中的用途。为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。如无特别说明，本专利技术中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本专利技术中材料、试剂、实验动物均可从市场上或其它公开渠道获得。在本专利技术中，gRNA与sgRNA含义相同。实施例1本专利技术的ADRB3基因敲除小鼠的一种实施例，该小鼠敲除了ADRB3基因的第2个外显子，其中，小鼠为8周龄、C57BL/6小鼠。实施例2本专利技术中敲除小鼠ADRB3基因的方法的一种实施例，该方法采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠ADRB3基因，其中，CRISPR/Cas9系统包括PD1411载体和表达sgRNA的寡核苷酸对，sgRNA靶向位于ADRB3基因第二个外显子首尾的两段核苷酸；寡核苷酸对两端设有可以整合到PD1411载体中的酶切位点；sgRNA的靶序列如SeqIDNO.1或SeqIDNO.2，以及SeqIDNO.3或SeqIDNO.4所示。实施例3本专利技术中敲除小鼠ADRB3基因的方法的一种实施例，包括如下步骤：(1)针对ADRB3基因的第二个外显子的上下游设计2组用于剪切的sgRNA，使用DNA2.0的sgRNA设计工具设计的寡核苷酸片段添加了SapI位点，由此可以克隆到PD1411载体中；四条sgRNA的靶序列的碱基序列如下：sgRNA1：GGGACACCCGCGGCACCGGA(SEQIDNO.1)GCAGGGGACGGAGAGCGCGA(SEQIDNO.2)sgRNA2：CTGTGTAGCTACGGTGGCCG(SEQIDNO.3)CGGAAGGCGTCGCGAAAGTC(SEQIDNO.4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠，其特征在于，所述小鼠敲除了ADRB3基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种小鼠，其特征在于，所述小鼠敲除了ADRB3基因。


2.根据权利要求1所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠敲除了ADRB3基因的第2个外显子。


3.根据权利要求1或2所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6小鼠。


4.根据权利要求1所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠为8周龄雄鼠。


5.一种敲除小鼠ADRB3基因的方法，其特征在于，所述方法采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠ADRB3基因。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括PD1411载体和表达sgRNA的寡核苷酸对，所述sgRNA靶向位于ADRB3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李贤，彭小芳，古燕霞，李锋，蔡兴东，郑猛，杜江，洪来法，胡小鹏，
申请(专利权)人：广州欣意生物技术有限公司，广州福榕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44