褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别涉及褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术公开了一种新型褐藻胶裂解酶ALB02668及编码该酶的基因序列和氨基酸序列，不但为市场提供了新的褐藻胶裂解酶资源，而且通过公开的基因序列和氨基酸序列，可实现褐藻胶裂解酶的异源表达应用和异源表达生产。本发明专利技术开发了利用大肠杆菌重组表达生产褐藻胶裂解酶ALB02668的方法与工艺，利用本方法，不但实现褐藻胶裂解酶ALB02668的重组生产，而且利用Ni‑NTA柱特异性吸附表达的蛋白，纯化效率大大提高。

【技术实现步骤摘要】
褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。
技术介绍
褐藻胶是褐藻中含量最丰富的线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种糖醛酸单体通过α/β-1,4糖苷键以不同的组合模式共同构成多聚古罗糖醛酸(poly-G)、多聚甘露糖醛酸(poly-M)和古罗糖醛酸与甘露糖醛酸随机聚合的杂合片段(poly-GM)。褐藻寡糖是褐藻胶的寡聚物，相对分子质量低、水溶性好、稳定性高及安全无毒，可以用作植物生长促进剂、抗氧化剂和肿瘤抑制剂等，在农业、食品和制药工业中有很好的应用前景。目前，褐藻寡糖主要通过酸法、氧化降解法、酶法等方法制备，酶法制备具有条件温和、容易控制、产物专一等优点，成为当前国内外研究热点之一。褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶，能够通过β消除反应生成寡糖产物。褐藻胶裂解酶可以基于底物特异性分为三种，一是聚古罗糖醛酸裂解酶，二是聚甘露糖醛酸裂解酶，三是对聚古罗糖醛酸和聚甘露糖醛酸同时具有活性。就作用方式而言，褐藻胶裂解酶可分为内切酶和外切酶，内切酶切割褐藻胶内糖苷键并释放不饱和低聚糖(二糖、三糖和四糖)，而外切酶可以进一步将寡糖降解为单体。褐藻胶裂解酶分布于7个多糖裂解酶家族中，分别是PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17和PL-18家族。褐藻胶裂解酶来源广泛，海洋藻类、海洋软体动物和微生物(包括细菌、真菌和一些病毒)等都有产生褐藻胶裂解酶的报道，其中关于微生物来源的报道最多。细菌主要包括假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)、弧菌(Vibrio)、黄杆菌(Flavobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、固氮菌(Azotobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、棒杆菌(Corynebacterium)、类单胞菌(Alteromonas)、肠杆菌(Enterobacter)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)等。真菌报道较少，在国外报道有Asteromycescruciatus、Corouosporaintermedia、Dendryphiellaarenaria、Dendryphiellasalina等。2018年高杨报道从南大洋沉积物中分离出红酵母属(Rhodotorula)、青霉菌属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)共10株产褐藻胶裂解酶真菌。1999年Suda首次在小球藻病毒基因中发现了有关褐藻胶裂解酶的基因片段，并对该基因表达的蛋白进行了表征。褐藻胶裂解酶不仅在褐藻寡糖制备领域具有广泛应用，在医药领域同样备受人们关注。自1928年发现青霉素至今，以青霉素为代表的抗生素从病魔手中挽救了无数的生命，给感染性疾病的治疗带来了巨大的变化。抗生素是通过抑制细胞壁、细胞膜、核酸或蛋白质等生命物质的合成，对细菌产生毒性的。然而，抗生素的长期使用，导致抗生素耐药菌株的出现，如对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素和四环素等抗生素耐药并呈上升趋势。近年来，由金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等引起的细菌感染导致的死亡率和治疗费用也在持续增加。英国政府2016年抗生素耐药性评估报告显示，全球每年约有70万人死于耐药菌感染，到2050年死亡人数可能达到1000万。世界卫生组织等监管机构宣布，抗生素的耐药性正在对全球健康构成威胁，发现新的治疗细菌感染的方法已迫在眉睫。国内外研究发现，细菌合成并附着在其表面的生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种天然屏障，起到保护功能。病原细菌生物膜一方面使细菌逃避机体免疫系统的作用，阻碍细胞吞噬作用，另外，可以阻止抗生素的渗透，降低了病原细菌对抗生素的敏感性。多糖是细菌生物膜的重要组分，降解细菌生物膜多糖，是提高抗生素疗效的新途径。本专利技术的褐藻胶裂解酶来源于申请人分离获得的类芽胞杆菌HB172198(Paenibacillussp.)，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.15412，保藏日期为：2018年03月05日。申请人已就该菌株及其应用申请了专利(一种类芽胞杆菌菌株HB172198及其应用，申请号201810891281.2)。在该专利中，申请人就菌株HB172198、菌株HB172198发酵产酶工艺、菌株HB172198产生的酶在降解褐藻上的应用申请保护。虽然通过类芽胞杆菌HB172198发酵方法可以获得褐藻胶裂解酶，但发酵产物组成复杂，褐藻胶裂解酶氨基酸序列与空间结构无从知晓，获得的发酵产物中褐藻胶裂解酶纯度较低，分离纯化成本高。因此，如何在降低分离纯化成本的情况下获得高纯度褐藻胶裂解酶，成为了研究人员需要攻克的技术难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。本专利技术通过基因组测序与生物信息学技术，获得了编码褐藻胶裂解酶ALB02668的基因及酶的氨基酸序列，并开发了利用大肠杆菌重组表达的方法生产该酶及其应用方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供了编码上述褐藻胶裂解酶的基因，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了一种褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列在SEQIDNO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。本专利技术还提供了编码褐藻胶裂解酶的基因；该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列在SEQIDNO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。本专利技术还提供了一种重组质粒，重组质粒为插入上述基因的质粒载体。作为优选，质粒载体为pET-28a质粒载体。本专利技术还提供了一种工程菌株，工程菌株为转入所得重组质粒的大肠杆菌。作为优选，大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术还提供了一种生产上述褐藻胶裂解酶的方法，将所得工程菌株接种于LB培养基中进行培养，诱导表达后离心，得到上清液I和菌体；将菌体裂解后离心，得到上清液II；将上清液I和上清液II合并，采用Ni-NTA柱纯化表达的蛋白，经过淋洗、洗脱，获得粗蛋白液；粗蛋白液经过透析、PEG包埋浓缩，获得褐藻胶裂解酶。本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶或褐藻中的应用。本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶在降解病原微生物胞外多糖、提高抗生素对病原微生物杀灭效果中的应用。本专利技术提供了褐藻胶裂解酶ALB02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用。该褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术具有的有益效果为：1.本专利技术公开了一种新型褐藻胶裂解酶A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.编码权利要求1所述褐藻胶裂解酶的基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。


3.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列在SEQIDNO:1所示氨基酸序列基础上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸。


4.编码权利要求3所述褐藻胶裂解酶的基因。


5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为插入权利要求2或4所述基因的质粒载体。


6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体为pET-28a质粒载体。


7.一种工程菌株，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍时翔，黄惠琴，郑志国，朱军，邹潇潇，孟天，胡永华，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46