一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途。山田平脐蠕孢菌菌株(HXDC‑1‑2)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17778。利用该菌株的分生孢子的浓度为每毫升10

【技术实现步骤摘要】
一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途
本专利技术属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的
，具体涉及一种山田平脐蠕孢菌菌株Bipolarisyamadae(Y.Nisik.)Shoemaker(HXDC-1-2)、其筛选和鉴定方法及其用途。
技术介绍
草害是导致作物减产的最主要因素之一，每年导致全球农业950亿美元损失。中国农田草害面积约7880万公顷，在每年投入235亿元人民币杂草防除费用情况下，仍然造成粮、棉、油损失1460万t，直接经济损失近千亿元人民币。稗、野燕麦、看麦娘、马唐、千金子、牛筋草、狗尾草、藜、鸭舌草为农田十大害草，其中禾本科占80％。自从人类开始从事农业生产活动以来，尝试对其进行防除的努力从未停止，20世纪50年代初，化学除草剂因其使用方便、见效快等特点而得到迅速发展。随着化学除草剂的广泛使用，带来的负面影响也日益明显。大量施用化学除草剂带来了环境污染危机；长残效除草剂的应用引起了残毒药害，导致下茬作物减产甚至土地退化。全世界已有100余种化学除草剂在30余个国家被禁用或取消登记。抗药性杂草种群的形成，全球已发现188种杂草的324个生物型对19类化学除草剂产生了抗药性，使得药效降低、用药量增加、成本提高，也更加重了污染。后果是导致除草剂品种的单一化，增加了抗性演化风险，也增强了市场对研制广谱、高效、低毒新除草剂和发展生物除草的技术需求。发展绿色除草剂特别是生物除草剂替代化学除草剂，是解决这一矛盾的重要途径。此外，相对于每个新型化学除草剂高达1亿美元的研制成本，研制生物除草剂的成本要低数十倍甚至上百倍。世界许多国家实施的农业可持续发展战略推动了此项技术的发展，因而研制生物除草剂成为对抗这些禾本科杂草的新途径。但目前少有有效的生物除草剂来针对这些禾本科杂草。生物除草剂是指在人工控制下施用人工培养繁殖的大剂量生物制剂杀灭杂草。具有二个显著的特点：一是经过人工大批量生产而获得大量生物接种体；二是淹没式应用，以达到迅速感染、并在较短时间里杀灭杂草。1981年，DeVine在美国被登记注册为第一个生物除草剂。DeVine是土生于美国佛罗里达州的棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora)致病菌株的厚垣孢子悬浮剂，用于防除杂草莫伦藤(Morreniaodorata)，防效可达90％且持效期可达2年，被广泛用于该州橘园。随后，Collego获得登记，并实用化。基因工程和细胞融合技术的介入，可以重组自然界存在的优良除草基因(如强致病和产毒素等)，给人们提供了改良生物除草剂品种、提高防效和改良寄主专一性的可能性。目前商业化的生物除草剂除了80年代研制外，90年代末推出的Camperico和Biochon，这些除草剂在控制相应的目标杂草上起到了重要作用，甚至是唯一的选择。在已被研究的候选生防真菌又相对集中在如下几个属：炭疽菌属(Colletotrichum)有18种，镰刀菌属(Fusarium)13种，链格孢菌属(Alternaria)12种，尾孢菌属(Cercospora)8种，柄锈菌属(Puccinia)，核盘菌属(Sclerotinia)，叶黑粉菌属(Entyloma)，壳单胞菌属(Ascochyta)。目前成功用于作物生产并申请专利的主要有炭疽菌属(Colletotrichumspecies)(US3,849,104和US3,999,973)；镰刀菌属(Fusariumspecies)(US4,419,120)；链格孢属(Alternariaspecies)(US4,390,360)；壳单孢菌属(Ascochytaspecies)(US4,915,724)以及核盘菌属(Selerotiniaspecies)(CAOZ,292,233)；小菌核菌属(Sclerotiumrolfsii)(SC64)等。目前国内对于平脐蠕孢属已有狗尾草平脐蠕孢、玉蜀黍平脐蠕孢和稷平脐蠕孢用于生物除草剂的专利，尚没有山田平脐蠕孢菌的申报，也没有其应用在作物田禾本科杂草和草坪杂草以及柔枝莠竹及其近缘种的生物防除报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对水稻、玉米、大豆、花生、芝麻、粟、蚕豆、豌豆、油菜、蔬菜、花卉、中药材、果树等作物田的杂草(稗草、狗尾草、马唐、牛筋草、千金子、虮子草、野燕麦、看麦娘、假高粱、柔枝莠竹等禾本科杂草，碎米莎草、旋鳞莎草、扁穗莎草等一年生莎草以及如葎草、合萌、藜、小藜等阔叶杂草)，筛选一种山田平脐蠕孢菌菌株，用于生物除草，高效、环保，成本低，无污染，对农作物安全，除草效果明显。为达以上目的，本专利技术公开了一种山田平脐蠕孢菌菌株、其筛选和鉴定方法及其用途，采用的技术方案如下：一种山田平脐蠕孢菌菌株，所述菌株为山田平脐蠕孢菌菌株HXDC-1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17778。优选地，所述菌株的菌落直径为50～60mm，灰黑色，菌落背面黑褐色，无水溶性色素；其分生孢子梗呈橄榄绿或黄褐色，单生或少数丛生，顶端色浅，屈膝状弯曲，宽4.5～9.5μm；其分生孢子呈黄褐色至深褐色，拟纺锤形或倒棍棒形，直或微弯，中部略宽，两端略窄，基细胞钝圆，光滑，6～9个假隔膜，54.5～92.5×12.5～17.5μm。一种山田平脐蠕孢菌菌株的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：步骤1)将该菌株于28℃黑暗培养箱培养四天，采用真菌gDNA提取试剂盒提取DNA，分别利用rDNAITS序列、GPDH序列和EF1α序列进行PCR扩增，其通用引物分别为ITS4、ITS5、GPD1、GPD2、EF1-983F、EF1-2218R；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’GPD1：5’-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3’GPD2：5’-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3’EF1-983F：5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’EF1-2218R：5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’步骤2)将步骤1)得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pMD19载体，转化大肠杆菌DH5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌，得到菌液；步骤3)对步骤2)制得的菌液进行测序，所测结果在Genbank中核酸数据库的ITS、GPDH和EF1α相关序列进行同源性比较；步骤4)经扩增测序比对后，EF1α扩增序列MK026429、KY905693分别与Bipolarisyamadae模式菌株ACCC36334、CBS127087同源性均为99％以上，ITS扩增序列MF490813与Bipolarisyamadae模式菌株CPC28807的同源性为99％以上，GPDH扩增序列MF490835与Bipolarisyamadae模式菌株CPC28807同源性为99％，可确定菌株为山田平脐蠕孢菌。利用上述分子标记作为引物，也可以进行检测，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种山田平脐蠕孢菌菌株，其特征在于，所述菌株为山田平脐蠕孢菌菌株HXDC-1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17778。/n

【技术特征摘要】
1.一种山田平脐蠕孢菌菌株，其特征在于，所述菌株为山田平脐蠕孢菌菌株HXDC-1-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17778。


2.根据权利要求1所述的一种山田平脐蠕孢菌菌株，其特征在于，所述菌株的菌落直径为50～60mm，灰黑色，菌落背面黑褐色，无水溶性色素；其分生孢子梗呈橄榄绿或黄褐色，单生或少数丛生，顶端色浅，屈膝状弯曲，宽4.5～9.5μm；其分生孢子呈黄褐色至深褐色，拟纺锤形或倒棍棒形，直或微弯，中部略宽，两端略窄，基细胞钝圆，光滑，6～9个假隔膜，54.5～92.5×12.5～17.5μm。


3.权利要求1所述的一种山田平脐蠕孢菌菌株的筛选和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)将该菌株于28℃黑暗培养箱培养四天，采用真菌gDNA提取试剂盒提取DNA，分别利用rDNAITS序列、GPDH序列和EF1α序列进行PCR扩增，其通用引物分别为ITS4、ITS5、GPD1、GPD2、EF1-983F、EF1-2218R；
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
GPD1：5’-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3’
GPD2：5’-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3’
EF1-983F：5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’
EF1-2218R：5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’
步骤2)将步骤1)得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pMD19载体，转化大肠杆菌DH5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌，得到菌液；步骤3)对步骤2)制得的菌液进行测序，所测结果在Genbank中核酸数据库的ITS、GPDH和EF1α相关序列进行同源性比较；
步骤4)经扩增测序比对后，EF1α扩增序列MK026429、KY905693分别与Bipolarisyam...

【专利技术属性】
技术研发人员：强胜，谭敏，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32