分析托酚酮的方法技术

本文公开了用于检测和/或定量样品中托酚酮的方法，例如在产物(例如，重组蛋白，如抗体)的最终制剂中或其生产期间产生的托酚酮。通过添加部分或完全氟化的烷基或芳基(例如五氟苯基丙基)，其(共价)结合托酚酮样的化合物，将托酚酮及其衍生物(环庚三烯酮)从混合物分离。然后通过紫外或串联质谱法对其进行分析。还公开了托酚酮样的化合物和氟化烷基或芳基的反应混合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分析托酚酮的方法本申请要求2017年12月5日提交的美国申请62/594,863的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。专利
本公开涉及在产物(例如重组蛋白，如抗体)生产期间对托酚酮进行检测和/或定量的方法。
技术介绍
托酚酮(2-羟基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)是一种在细胞培养基中使用以促进金属离子摄取的小分子，这对于细胞的生长是必需的，例如在生物制造中使用的那些细胞。因为托洛酮是在产品生产过程中添加到细胞培养物中的合成化学物质，所以管理生物产品的监管机构经常要求证明托洛酮的清除。因此，需要以简单、快速、有效的方式对多种生物制药产品中的托洛酮进行分离、检测和定量的方法。
技术实现思路
本文所述的方法和组合物提供了从其他样品组分中快速且容易分离式I化合物(例如托酚酮)以及对式I化合物(例如托酚酮)、水平和清除进行测试。这样可以评估产物的纯度。本文所述的方法和组合物可以使式I化合物(例如托酚酮)的调节延迟(regulatorydelay)以及时间和资源消耗测试最小化。因此，在本专利技术的一个方面中涉及从样品另一组分中分离式I化合物(例如托酚酮)的方法，所述方法包括：在其中使式I化合物(例如托酚酮)与部分缔合(例如结合至该部分或被该部分保留)至大于组分的程度的情况下，使样品与部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基丙基)部分接触，由此，将式I化合物，例如托酚酮与组分分离，其中式I为：且其中：X是O或S；R1是氢、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、OR3、C(O)R5、C(O)OR3、N(R4a)(R4b)、C(O)N(R4a)(R4b)、或N(R4a)C(O)R5；各R2独立地是C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、N(R4a)(R4b)、C(O)N(R4a)(R4b)、或N(R4a)C(O)R5；或者两个R2连接形成任选被一个或多个R6取代的杂环基环；或者R1和R2连接形成任选被一个或多个R6取代的杂环基环；R3是氢、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；R4a和R4b独立地是氢、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；R5是C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；各R6独立地是C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、卤素、氧代或氰基；和n为0、1、2、4或5；在另一方面中，本专利技术涉及一种评估含产物的样品中式I化合物(例如，托酚酮)存在(例如水平)的方法，该方法包括：a)i)提供样品的等分试样，例如式I化合物(例如托酚酮)的耗尽相(例如流动相)，其中式I化合物(例如托酚酮)已与样品的另一种组分分离，或者ii)使所述样品经受其中式I化合物例如托酚酮与样品的另一种组分分离的条件，例如以形成式I化合物(例如托酚酮)富集相或等分试样和式I化合物(例如托酚酮)耗尽相或等分试样；和b)评估式I化合物(例如托酚酮)的存在(例如水平)，例如确定样品中式I化合物(例如托酚酮)的水平的值：i)使用串联质谱(MS2)，或ii)使用紫外线(UV)吸收(例如约242nm或约238nm的紫外线吸收)；由此分析所述样品。在另一方面中，本专利技术涉及一种反应混合物，其包含部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基丙基)部分以及含式I化合物(例如托酚酮)、另一组分和任选产物的样品。在另一方面中，本专利技术涉及一种制备产物(例如重组多肽)的方法，所述方法包括：提供包含所述产物和任选的式I化合物(例如托酚酮)的样品，其中：通过本文所述的方法分析样品，或通过本文所述的方法将式I化合物(例如托酚酮)与样品的另一组分分离。附图说明图1显示了使用UV检测通过RP-HPLC分离的托酚酮的色谱图的两个视图；底部图是顶部图的放大图。图2显示了使用Luna-NH2色谱柱分离后表1中SRM跃迁的总离子流(TIC)曲线。图3显示了使用DiscoveryHSF5-3(Supelco)色谱柱分离后表1中SRM跃迁(transition)的TIC痕迹。图4显示了显示水中托酚酮标准物的校准曲线图并测定线性范围的曲线图，。图5显示了三个处理中样品的TIC痕迹，各样品均未显示托酚酮峰。图6显示了三个处理中样品的TIC痕迹，其中三个样品或者掺有托酚酮(顶部三个)，或者未掺有托洛酮(底部三个)。图7显示了两个色谱图，使用紫外吸收为242nm(顶部)和238nm(底部)检测通过实施例2中确定的色谱方法处理的托酚酮标准物中的托酚酮。图8A和8B显示了本公开的示例性LC方法的详细参数。具体实施方式为了使重组生物药物蛋白成为人类患者给药可接受的，重要的是从最终生物产物(例如重组多肽)中去除由制造和纯化过程产生的残留污染物。这些过程污染物包括在培养细胞和纯化生物产物过程中添加到培养基中的化合物。美国和外国法规通常要求去除此类污染物。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求意图用于人体内使用的生物药物应尽可能不含外源性免疫球蛋白和非免疫球蛋白杂质，并要求进行测试以检测并定量潜在杂质。同样，国际协调会议(ICH)提供了有关生物技术/生物产品的测试程序和接受标准的指南。托酚酮(2-羟基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)是七元芳香环。其具有多种用途，包括用作化妆品和局部药物制剂中的抗氧化剂，用作防晒品中的紫外线吸收剂以及用作儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂。可以将托酚酮添加到细胞培养基中，以促进培养细胞中金属离子的摄取。在一些实施方式中，以小于或等于0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml、1.75mg/ml、2mg/ml、2.25mg/ml、2.5mg/ml、2.75mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、或10mg/ml的浓度将托酚酮添加至细胞培养基。在一些实施方式中，可以将式I化合物(例如托酚酮)添加到细胞培养基中，以促进培养细胞中金属离子的摄取。在一些实施方式中，以小于或等于0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml、1.75mg/ml、2mg/ml、2.25mg/ml、2.5mg/ml、2.75mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、或10mg/ml的浓度将式I化合物(例如托酚酮)添加至细胞培养基。作为添加到用于生产生物制品的细胞培养物中的合成化学品，许多监管机构要求：例如在可以宣布其对人体内使用安全之前，证明从生物制品中清除式I化合物(如托酚酮)。许多制造或生产生物产物的方法都包括亲和色谱步骤，例如，使用包含选择性保留所需生物产物的树脂的色谱柱，并且期望式I化合物(如托酚酮)在所需的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使式I化合物如托酚酮与样品中另一组分分离的方法，所述方法包括：/n在其中使式I化合物如托酚酮与部分或完全氟化的烷基或芳基部分缔合的程度大于与组分缔合的程度的条件下，使样品与所述部分接触，其中所述缔合例如是结合至所述部分或被所述部分保留，所述部分或完全氟化的烷基或芳基为例如氟苯基，如五氟苯基丙基，/n由此，将式I化合物如托酚酮与组分分离，其中式I为：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171205 US 62/594,8631.一种使式I化合物如托酚酮与样品中另一组分分离的方法，所述方法包括：
在其中使式I化合物如托酚酮与部分或完全氟化的烷基或芳基部分缔合的程度大于与组分缔合的程度的条件下，使样品与所述部分接触，其中所述缔合例如是结合至所述部分或被所述部分保留，所述部分或完全氟化的烷基或芳基为例如氟苯基，如五氟苯基丙基，
由此，将式I化合物如托酚酮与组分分离，其中式I为：

且其中：
X是O或S；
R1是氢、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、OR3、C(O)R5、C(O)OR3、N(R4a)(R4b)、C(O)N(R4a)(R4b)、或N(R4a)C(O)R5；
各R2独立地是C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、N(R4a)(R4b)、C(O)N(R4a)(R4b)、或N(R4a)C(O)R5；或者
两个R2连接形成任选被一个或多个R6取代的杂环基环；或者R1和R2连接形成任选被一个或多个R6取代的杂环基环；
R3是氢、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；
R4a和R4b独立地是氢、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；
R5是C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；
各R6独立地是C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、卤素、氧代或氰基；并且
n为0、1、2、4或5。


2.如权利要求1所述的方法，其中，所述部分包括五氟苯基丙基。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，五氟苯基丙基与基质缔合，例如，结合，例如，共价结合。


4.如权利要求3所述的方法，其中，所述基质包括不溶性基质，例如色谱基质，例如，二氧化硅凝胶。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括：在其中化合物优先洗脱的情况下，使所述部分与一种或多种流动相(例如，一种或两种流动相)接触。


6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述方法包括：使得样品经受液相色谱(LC)分离。


7.一种评估含产物的样品中式I化合物如托酚酮的存在如水平的方法，所述方法包括：
a)i)提供样品的等分试样，例如式I化合物(例如托酚酮)的耗尽相，例如流动相，其中，式I化合物例如托酚酮已与样品的另一种组分分离，或者
ii)使样品经受其中式I化合物例如托酚酮与样品的另一种组分分离的条件，例如以形成式I化合物例如托酚酮的富集相或等分试样和式I化合物例如托酚酮的耗尽相或等分试样；和
b)评估式I化合物例如托酚酮的存在，例如其水平，例如确定样品中式I化合物例如托酚酮的水平的值：
i)使用串联质谱(MS2)，或
ii)使用紫外线(UV)吸收(例如约242nm或约238nm的紫外线吸收)；
由此分析所述样品，
其中，式I是：



且其中：
X是O或S；
R1是氢、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、OR3、C(O)R5、C(O)OR3、N(R4a)(R4b)、C(O)N(R4a)(R4b)、或N(R4a)C(O)R5；
各R2独立地是C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、N(R4a)(R4b)、C(O)N(R4a)(R4b)、或N(R4a)C(O)R5；或者
两个R2连接形成任选被一个或多个R6取代的杂环基环；或者R1和R2连接形成任选被一个或多个R6取代的杂环基环；
R3是氢、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；
R4a和R4b独立地是氢、C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；
R5是C1-C6烷基或C1-C6杂烷基；
各R6独立地是C1-C6烷基、C1-C6杂烷基、卤素、氧代氰基；并且
n为0、1、2、4或5。


8.如权利要求7所述的方法，其中，a)包括：提供样品的等分试样，例如式I化合物例如托酚酮的耗尽相，例如流动相，其中，式I化合物例如托酚酮已与样品的另一种组分分离。


9.如权利要求7所述的方法，其中，a)包括：使样品经受其中式I化合物例如托酚酮与样品的另一种组分分离的条件，例如以形成式I化合物例如托酚酮的富集相或等分试样和式I化合物例如托酚酮的耗尽相或等分试样。


10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，a)包括：使得样品经受液相色谱(LC)分离。


11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中，a)包括：在其中使式I化合物例如托酚酮与部分或完全氟化的烷基或芳基部分缔合的程度大于与组分缔合的程度的条件下，使样品与所述部分接触，其中，所述缔合例如结合至所述部分或被所述部分保留，所述部分或完全氟化的烷基或芳基为例如氟苯基，如五氟苯基丙基。


12.如权利要求11所述的方法，其中，所述部分包括五氟苯基丙基。


13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中，b)包括：评估式I化合物例如托酚酮的水平或存在，例如，使用串联质谱(MS2)确定样品中式I化合物例如托酚酮的水平的值。


14.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中，b)包括：评估式I化合物例如托酚酮的水平或存在，例如，使用紫外线(UV)吸收，例如约242nm或约238nm的紫外线吸收，来确定样品中式I化合物例如托酚酮的水平的值。


15.如权利要求7、11或12中任一项所述的方法，所述方法还包括：a)i)和b)i)。


16.如权利要求7、11或12中任一项所述的方法，所述方法还包括：a)i)和b)ii)。


17.如权利要求7、11或12中任一项所述的方法，所述方法还包括：a)ii)和b)i)。


18.如权利要求7、11或12中任一项所述的方法，所述方法还包括：a)ii)和b)ii)。


19.如权利要求7-18中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法具有约0.1-10000μg/ml、0.2-8000μg/ml、0.3-7000μg/ml、0.4-6000μg/ml、0.5-5000μg/ml、0.5-4000μg/ml、0.5-3000μg/ml、0.5-2000μg/ml、或0.5-1000μg/ml的线性范围，例如0.5-1000μg/ml。


20.如权利要求7-19中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的线性范围的下限为约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、或1μg/ml，例如0.5μg/ml。


21.如权利要求7-20中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的线性范围的上限为约500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1400μg/ml、1600μg/ml、1800μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、5000μg/ml、6000μg/ml、7000μg/ml、8000μg/ml、9000μg/ml、或10,000μg/ml，例如1000μg/ml。


22.如权利要求7-21中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的精度(例如，由重复样品之间标准偏差所表示)可以小于或等于约0％、40％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％，例如17％、16.5％、或16％。


23.如权利要求7-22中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的准确度(例如，由三个不同样品中平均单点添加回收率所表示)可以大于或等于约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％，例如91％。


24.如权利要求7-23中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的检测下限为约1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml、或10μg/ml，例如5μg/ml。


25.如权利要求6或10中任一所述的方法，其中，LC是反相色谱。


26.如权利要求6或10中任一所述的方法，其中，LC不是反相色谱。


2...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·A·维尔克斯，
申请(专利权)人：隆萨有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH