改善单克隆抗体的检测结果的方法技术

本发明专利技术提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法，所述方法包括以下的步骤：(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤；(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤；及(c)通过液相色谱质谱分析(LC‑MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。根据本发明专利技术，可以期待使用了质谱分析的单克隆抗体的检测方法的进一步的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善单克隆抗体的检测结果的方法
本专利技术涉及改善利用质谱分析进行单克隆抗体定量时的检测结果的方法。更具体而言，本专利技术涉及为了定量单克隆抗体而已确立的方案的改良。
技术介绍
近些年，作为替代ELISA法的定量法，积极进行了使用LC-MS/MS法的抗体药物的生物催化剂的开发。本专利技术人等小组发现：通过将测定对象的单克隆抗体及能将其作为底物消化的蛋白酶这两者固定化于固相，从而能够通过区域选择性的固相-固相反应而实现单克隆抗体的蛋白酶解，成功地获得了各个单克隆抗体特有的肽(专利文献1～6和非专利文献1～8)。该方法是使将单克隆抗体固定化于细孔内的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的质谱分析的前处理方法，是能够通过液相色谱质谱分析(LC-MS)对得到的肽片段进行有效地检测和定量的突破性技术。本专利技术人等将本方法命名为“纳米表面和分子取向限制蛋白质水解(nano-surfaceandmolecular-orientationlimitedproteolysis)方法(nSMOL法)”。基于nSMOL法进行的血中抗体药物的定量是如下方法：能够仅对具有抗体药物的特异性序列的Fab域限定性胰蛋白酶解、抑制在LC-MS/MS分析中视为最棘手问题的离子抑制效果，从而提供更稳定的可靠性高的定量值。本专利技术人等已经确认了：在15种以上的抗体药物的血药浓度测定中，组合nSMOL法和LC-MS/MS法而使用的单克隆抗体的检测方法符合日本、美国和欧洲的用于验证生物学分析方法的准则的基准。另一方面，已知作为生物高分子的蛋白质中存在具有非常特征性的坚硬的(刚性)结构的蛋白质。例如，β淀粉样蛋白、转铁蛋白、多个跨膜型蛋白质(视紫红质、转运蛋白等)中，尽管机理不同，但已知通过采用刚性结构其作用分别得到了控制。作为使蛋白质结构保持刚性的结构之一，有通过SS键而产生如结扣状那样的结构的半胱氨酸结结构。作为具有半胱氨酸结结构、有助于特异性信号传递的分子，可列举出血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素等细胞因子类。抗体分子是由2根重链和2根轻链组成的4聚体高分子量蛋白质，在各自链中存在：具有抗体特异性氨基酸序列而定义抗体结构的多样性、功能的可变区；和、分子结构相同的恒定区。在可变区中，突变的频率也特别高且决定与抗原的结合性的区域是互补决定区(CDR)；另外，在重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间存在被称为铰链的灵活性非常高的结构。由于抗体分子中存在铰链，因此使抗体结合部位(抗原结合片段：Fab,fragmentantigenbinding)的立体结构学的波动得以确保，利用NMR分析等进行分子动力学解析时，尽管Fc位点几乎被三维地固定，但已知Fab位点大幅波动以至无法三维地分配。在抗原发生结合时该波动收敛而变为刚性结构。另外，在抗体分子中，在分子内和分子间存在大量SS键，具有保持各自的区域的作用。可认为：根据抗体分子本身、周围的微细结构环境，涉及SS键的硫原子的氧化还原电位不同，SS键强度也存在差异。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开WO2015/033479号专利文献2：国际公开WO2016/194114号专利文献3：国际公开WO2016/143224号专利文献4：国际公开WO2016/143223号专利文献5：国际公开WO2016/143226号专利文献6：国际公开WO2016/143227号非专利文献非专利文献1：Analyst.2014Feb7；139(3):576-80.doi:10.1039/c3an02104a非专利文献2：Anal.Methods,2015；21:9177-9183.doi:10.1039/c5ay01588j非专利文献3：DrugMetabolismandPharmacokinetics,2016；31:46-50.doi:10.1016/j.dmpk.2015.11.004非专利文献4：Bioanalysis.2016；8(10):1009-20.doi:10.4155.bio-2016-0018非专利文献5：BiolPharmBull,2016；39(7):1187-94.doi:10.1248/bpb.b16-00230非专利文献6：JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci；2016；1023-1024:9-16.doi:10.1016/j.jchromb.2016.04.038非专利文献7：ClinPharmacolBiopharm2016；5:164.doi:10.4172/2167-065X.1000164非专利文献8：J.PharmBiomedAnal；2017；145:33-39.doi:10.1016/j.jpba.2017.06.032
技术实现思路
专利技术要解决的问题nSMOL法中具有如下反应机制：通过使固定在直径约200nm的纳米颗粒表面的蛋白酶与固定在细孔直径约100nm的多孔体的免疫球蛋白分子接触，从而在被限制的反应场中选择性切断免疫球蛋白分子的Fab。nSMOL法的精度/灵敏度/再现性优异，为了实施nSMOL法，LC/MS/MS用前处理试剂盒“nSMOLAntibodyBAKit”(岛津制作所)已经有所市售，还提供与试剂盒组合的方案。但本专利技术人等为了使nSMOL法的通用性进一步扩大，而进行了方案改良等的研究。其中，本专利技术人等确认了：在作为抗体药物使用的单克隆抗体中，存在与其它单克隆抗体相比检测结果极低的分子。若从nSMOL法的精度和灵敏度方面考虑，可认为在临床使用中没有问题，但为了以更高的可靠性检测微量的抗体浓度，考虑有能进一步改良步骤的可能性。用于解决问题的方案本专利技术人等预料出：检测结果变低的情况可能是由测定对象的抗体分子的硬度引起的蛋白酶耐性所导致的，但不受理论约束。即，在这样的抗体分子中，由于某种机制例如由于SS键所致的半胱氨酸结结构的存在，而存在非常刚性的区域并发生针对蛋白酶的耐性，其结果，有可能未进行在nSMOL法中所预测的蛋白酶解。从原理上，nSMOL法由于在立体结构上控制蛋白酶与底物的接触部位，因此假设对全部抗体的Fab域选择性地进行蛋白酶反应。也已证实了确实进行了不依赖于抗体的多样性反应。然而，抗体分子其本身为非常刚性的情况下，即使与底物接触，也可能对能抗体定量的部位不进行基于蛋白酶的的水解。为了使nSMOL法适用于所有的单克隆抗体药物，而进行了各种针对上述那样的刚性单克隆抗体的分析条件的研究，结果本专利技术人等发现：在从样品中分离出抗体分子后，通过酸性还原条件而使SS键快速裂解，由此能够使其具有空间上的波动，显著改善利用nSMOL法的检测结果。由于蛋白A与Fc的键在酸性还原条件下不会解离，因此认为能够在将抗体分子保持于多孔体上情况下将半胱氨酸结结构拆解。即，本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，其包括以下的步骤：/n(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、/n(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和/n(c)通过液相色谱质谱分析即LC-MS来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，/n在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种样品中的单克隆抗体的检测方法，其包括以下的步骤：
(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤、
(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤、和
(c)通过液相色谱质谱分析即LC-MS来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，
在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过在有机磷系还原剂的存在下的孵育来实施步骤(a’)。


3.根据权利要求2所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：岩本典子，岛田崇史，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：日本;JP