【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因治疗的腺相关病毒载体交叉引用本申请要求于2017年6月30日提交的第62/527,937号美国临时申请、2018年4月18日提交的第62/659,472号美国临时申请和2018年5月1日提交的第62/665,256号美国临时申请的权益，所述申请均通过引用并入本文。序列表本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2018年6月29日的所述ASCII副本被命名为47533-726_601_SL.txt，大小为5,955,965个字节。
技术介绍
尽管癌症治疗在过去50年中取得了显著进步，但仍存在许多对于化学疗法、放射疗法或生物疗法为顽固性的肿瘤类型，特别是在通过手术技术无法解决的晚期。近来，在用来体内识别肿瘤上的分子靶标的淋巴细胞遗传工程方面取得了显著进步，从而导致了引入注目的靶向肿瘤缓解病例。然而，这些成功在很大程度上局限于血液系统肿瘤，而针对实体瘤的更广泛应用受限于缺乏由特定肿瘤中的细胞表达的可鉴别分子以及缺乏可用来特异性结合肿瘤靶标以便介导肿瘤破坏的分子。本文公开的组合物和方法提供了修饰的腺相关病毒载体，以及鉴定增强细胞治疗的修饰的腺相关病毒载体的方法。使用修饰的腺相关病毒方法将转基因插入原代细胞中是创新的方法，为扩展和改善针对各种病况如癌症的免疫疗法开辟了新的机会。援引并入本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在本文中的术语与所并入的参考文献中的...
【技术保护点】
1.一种分离的非天然存在的核酸，其包含与野生型AAV核苷酸序列相比在VP1区中包含第一突变并在VP3区中包含第二突变的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其中所述分离的非天然存在的核酸在与多个细胞接触后，与野生型AAV核酸或在所述衣壳蛋白的VP区中具有单个突变的AAV核苷酸序列在相当的多个细胞中相比，在所述多个细胞中转染或转导后的转基因表达增加。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,937;20180418 US 62/659,472;20181.一种分离的非天然存在的核酸，其包含与野生型AAV核苷酸序列相比在VP1区中包含第一突变并在VP3区中包含第二突变的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其中所述分离的非天然存在的核酸在与多个细胞接触后，与野生型AAV核酸或在所述衣壳蛋白的VP区中具有单个突变的AAV核苷酸序列在相当的多个细胞中相比，在所述多个细胞中转染或转导后的转基因表达增加。
2.一种分离的非天然存在的核酸，其包含与野生型AAV核苷酸序列相比在VP1区中包含第一突变并在VP2区中包含第二突变的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其中所述分离的非天然存在的核酸在与多个细胞接触后，与野生型AAV核酸或在所述衣壳蛋白的VP区中具有单个突变的AAV核苷酸序列在相当的多个细胞中相比，在所述多个细胞中转染或转导后的转基因表达增加。
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中所述AAV核苷酸序列是血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及其任意组合的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中所述AAV核苷酸序列是AAV6血清型的核苷酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸是DNA或RNA中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸是DNA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸，其中所述第一突变和所述第二突变包括点突变、错义突变、无义突变、插入、缺失、重复、移码或重复扩展中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的核酸，其中所述第一突变和所述第二突变是点突变。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中所述第一突变是所述VP1区中的苯丙氨酸(F)编码序列的突变。
10.根据权利要求9所述的核酸，其中所述第一突变在由所述核酸编码的多肽的位置129处的F编码序列中。
11.根据权利要求10所述的核酸，其中所述突变编码从所述多肽的第129位F突变为非极性脂族氨基酸的突变。
12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述非极性脂族氨基酸选自：亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)。
13.根据权利要求12所述的核酸，其中所述非极性脂族氨基酸是L。
14.根据权利要求1和3至8中任一项所述的核酸，其中所述第二突变在所述多肽中的亮氨酸(L)编码序列中。
15.根据权利要求14所述的核酸，其中所述第二突变在由所述核酸编码的所述多肽的位置584处的L编码序列中。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述第二突变编码从所述多肽的第584位L突变为极性氨基酸的突变。
17.根据权利要求16所述的核酸，其中所述极性氨基酸选自：天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。
18.根据权利要求17所述的核酸，其中所述极性氨基酸是N。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的核酸，其中所述第二突变编码从第584位L突变为带正电荷的氨基酸的突变。
20.根据权利要求19所述的核酸，其中所述带正电荷的氨基酸是组氨酸(H)。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的核酸，其中所述第二突变编码从所述多肽的第584位L突变为带负电荷的氨基酸的突变。
22.根据权利要求21所述的核酸，其中所述带负电荷的氨基酸选自：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
23.根据权利要求22所述的核酸，其中所述带负电荷的氨基酸是D。
24.根据权利要求1和3至8中任一项所述的核酸，其中所述第二突变在所述多肽中的缬氨酸(V)编码序列中。
25.根据权利要求24所述的核酸，其中所述第二突变在由所述核酸编码的所述多肽的位置598处的V编码序列中。
26.根据权利要求25所述的核酸，其中所述第二突变编码从所述多肽的第598位V突变为非极性脂族氨基酸的突变。
27.根据权利要求26所述的核酸，其中所述非极性脂族氨基酸选自：亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)。
28.根据权利要求27所述的核酸，其中所述非极性脂族氨基酸是L。
29.根据权利要求27所述的核酸，其中所述非极性脂族氨基酸是I。
30.根据权利要求1和3至8中任一项所述的核酸，其中所述第二突变在所述多肽中的组氨酸(H)编码区中。
31.根据权利要求30所述的核酸，其中所述第二突变在所述多肽的位置642处的H编码区中。
32.根据权利要求31所述的核酸，其中所述第二突变编码从所述多肽的第642位H突变为极性氨基酸的突变。
33.根据权利要求32所述的核酸，其中所述极性氨基酸选自：天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。
34.根据权利要求33所述的核酸，其中所述极性氨基酸是N。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的核酸，其中所述第一突变在所述第二突变之前的核酸中的芳族氨基酸编码序列中，所述第二突变编码由所述核酸编码的多肽中的非极性脂族氨基酸。
36.根据权利要求35所述的核酸，其中所述芳族氨基酸在由所述VP1区编码的VP1多肽的位置129处。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的核酸，其中所述第一突变在这样的序列中，该序列编码的氨基酸比所述第二突变之前的所述序列的位置处编码的氨基酸具有更高的疏水性。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的核酸，其中所述第二突变编码选自下组的至少一种突变：带正电荷的氨基酸突变为极性氨基酸，带负电荷的氨基酸突变为极性氨基酸。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的核酸，其中所述第二突变编码保守突变。
40.根据权利要求39所述的核酸，其中所述保守突变选自：非极性脂族氨基酸突变为非极性脂族氨基酸，极性氨基酸突变为极性氨基酸，带正电荷的氨基酸突变为带正电荷的氨基酸，带负电荷的氨基氨基酸突变为带负电荷的氨基酸，以及芳族氨基酸突变为芳族氨基酸。
41.根据权利要求1至36中任一项所述的核酸，其中所述第一突变在这样的序列中，该序列编码的氨基酸比所述第二突变之前的所述序列的位置处编码的氨基酸具有更低的疏水性。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的核酸，其中当所述第二突变在VP3区中时，所述第二突变编码选自下组的至少一种突变：H至N，D至N，D至N，V至L，以及V至I。
43.根据权利要求42所述的核酸，其中VP3区中的所述第二突变在由所述AAV核苷酸序列编码的AAV多肽序列的位置418、462、584、598或642处发生。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸编码F129L、H642N和D418N突变中的至少一个。
45.根据权利要求1至43中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸编码F129L、H642N和L584N突变中的至少一个。
46.根据权利要求1至43中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸编码F129L、H462N和V598L突变中的至少一个。
47.根据权利要求1至43中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸编码F129L、H462N和V598I突变中的至少一个。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的核酸，其中所述多个细胞是多个原代细胞。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸编码外源受体序列的至少一部分。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸被配制成药物组合物。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的核酸，其中所述野生型AAV核酸与SEQIDNO:55具有至少60％的序列同一性。
52.一种分离并纯化的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其编码选自F129L、H642N和D418N的至少两个突变。
53.一种分离并纯化的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其编码选自F129L、H642N和L584N的至少两个突变。
54.一种分离并纯化的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其编码选自F129L、H462N和V598L的至少两个突变。
55.一种分离并纯化的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，其编码选自F129L、H642N和V598I的至少两个突变。
56.由根据权利要求52至55中任一项所述的腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列产生的分离并纯化的蛋白质。
57.一种分离并纯化的腺相关病毒(AAV)衣壳核酸序列，其与SEQIDNO:1至SEQIDNO:19中的任一核酸序列具有至少60％的序列同一性或相似性。
58.根据权利要求57所述的分离并纯化的AAV核酸序列，其中所述序列同一性为约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和高达约100％。
59.一种分离的非天然存在的核酸，其包含腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列，该AAV核苷酸序列包含VP1、VP2和VP3序列，其中所述VP1、VP2和VP3序列中的两个来自第一AAV血清型，而所述VP1、VP2和VP3序列之一来自第二AAV血清型，其中所述分离的非天然存在的核酸在引入多个细胞中后，赋予与野生型AAV核酸相比增加的转染或转导后转基因表达。
60.根据权利要求59所述的核酸，其中所述第一AAV血清型和所述第二AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或其任意组合。
61.根据权利要求59至60中任一项所述的核酸，其中所述第一AAV血清型和所述第二AAV血清型选自：AAV4和AAV6，AAV5和AAV6，AAV11和AAV6，AAV12和AAV6，及其任意组合。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸是DNA或RNA中的至少一种。
63.根据权利要求62所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸是DNA。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的核酸，其中所述细胞是原代细胞、无限增殖化细胞或重组细胞。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的核酸，其中所述转基因编码外源受体序列的至少一部分。
66.根据权利要求59至65中任一项所述的核酸，其中所述分离的非天然存在的核酸被配制成药物组合物。
67.根据权利要求59至66中任一项所述的核酸，其中所述VP1、VP2和VP3区被包含在衣壳的至少一部分内。
68.一种分离并纯化的腺相关病毒(AAV)衣壳核酸序列，其与SEQIDNO:195至SEQIDNO:213中的任一氨基酸序列具有至少60％的序列同一性或相似性。
69.根据权利要求68所述的分离并纯化的AAV核酸序列，其中所述序列同一性为约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和高达约100％。
70.一种通过用根据权利要求1至67中任一项所述的分离并纯化的AAV核酸序列转染细胞而产生的工程化细胞。
71.从根据权利要求70所述的工程化细胞中分离的多个腺相关病毒(AAV)颗粒。
72.一种单位剂型形式的组合物，其包含根据权利要求71所述的腺相关病毒颗粒。
73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述组合物是冷冻保存的。
74.一种容器，其包含根据权利要求72至73中任一项所述的组合物。
75.一种制备工程化细胞的方法，其包括使多个细胞与根据权利要求71所述的多个腺相关病毒(AAV)颗粒接触。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述多个细胞是哺乳动物细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述人细胞是淋巴细胞。
79.根据权利要求75至78中任一项所述的方法，其中所述细胞在与所述多个AAV颗粒的所述接触之前进行刺激。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述刺激用抗CD3、抗CD28和白介素中的至少一种进行。
81.根据权利要求79至80中任一项所述的方法，其中所述接触在所述刺激之前、之后或同时进行。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述多个细胞与所述多个AAV颗粒的所述接触在所述刺激之后进行。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的方法，其中所述刺激在所述多个细胞与所述多个AAV颗粒的所述接触之前4天至之前24小时进行。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述刺激在所述多个细胞与所述多个AAV颗粒的所述接触之前3天进行。
85.根据权利要求75至84中任一项所述的方法，其进一步包括在所述多个细胞的基因组中引入基因组破坏。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述基因组破坏包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。
87.根据权利要求85至86中任一项所述的方法，其中所述基因组破坏在所述多个细胞与所述多个AAV颗粒的所述接触之前进行。
88.根据权利要求75至87中任一项所述的方法，其进一步包括扩充所述工程化细胞。
89.根据权利要求75至88中任一项所述的方法，其进一步包括以单位剂型向有需要的受试者施用所述工程化细胞。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述施用是输注。
91.根据权利要求89至90中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞的所述施用至少部分地改善了所述有需要的受试者的疾病或病况。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述疾病或病况包括癌症。
93.根据权利要求91至92中任一项所述的方法，其中所述改善包括通过计算机断层摄影术(CT)扫描所测量的所述癌症减少至少约30％。
94.根据权利要求91至92中任一项所述的方法，其中所述改善包括稳定肿瘤大小，如通过计算机断层摄影术(CT)扫描所测量的肿瘤病变直径相比于基线测量值的变化小于10％所衡量的。
95.一种筛选多个工程化腺相关病毒(AAV)颗粒的方法，其包括：
a.将突变或外源AAV基因组中的至少一个引入到腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列的基因组中以形成工程化AAV颗粒；
b.将来自a的多个所述工程化AAV颗粒引入到多个细胞基因组中；以及
c.对在所述多个细胞基因组中由所述多个AAV颗粒编码的转基因的表达水平进行定量，其中将所述表达水平与从引入了与a不同的突变或外源AAV基因组的第二AAV颗粒获得的第二表达水平进行比较。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述突变包括点突变、错义突变、无义突变、插入、缺失、重复、移码或重复扩展中的至少一种。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述突变包括点突变。
98.根据权利要求95至97中任一项所述的方法，其中腺相关病毒(AAV)衣壳核苷酸序列的所述基因组是血清型AAV6的基因组。
99.根据权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述外源AAV基因组是血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12的基因组。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述外源AAV基因组是AAV4。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述外源AAV基因组是AAV5。
102.根据权利要求99所述的方法，其中所述外源AAV基因组是AAV11。
103.根据权利要求99所述的方法，其中所述外源AAV基因组是AAV12。
104.根据权利要求95至103中任一项所述的方法，其中所述多个细胞基因组来自原代细胞、无限增殖化细胞或重组细胞。
105.根据权利要求95至104中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术、Western印迹法或PCR确定所述表达的所述水平的所述定量。
106.根据权利要求95至105中任一项所述的方法，其中所述工程化的AAV颗粒在被引入所述多个细胞基因组时赋予与未工程化的AAV颗粒相比增加的转导后转基因表达。
107.根据权利要求106所述的方法，其中与从引入了与a不同的突变或外源AAV基因组的第二AAV颗粒获得的所述第二表达水平相比，所述增加的表达是约30％、40％、50％、60％以及高达约100％。
108.根据权利要求95至107中任一项所述的方法，其中通过流式细胞术、Western印迹法或PCR测量所述定量。
109.一种制备工程化细胞的方法，其包括使多个细胞与有效量的腺相关病毒(AAV)颗粒接触，所述AAV颗粒在衣壳蛋白的VP1区中包含第一突变并在VP3区中包含第二突变，从而产生多个工程化细胞，其中与接触野生型AAV颗粒或在所述衣壳蛋白VP区中包含单个突变的AAV颗粒的相当的多个细胞相比，所述工程化细胞转导后转基因的表达增加。
110.一种制备工程化细胞的方法，其包括使多个细胞与有效量的腺相关病毒(AAV)颗粒接触，所述AAV颗粒在衣壳蛋白的VP1区中包含第一突变并在VP3区中包含第二突变，从而产生多个工程化细胞，其中在200,000GC/mL的平均传染力(MOI)下，与以所述MOI接触野生型AAV颗粒或在所述衣壳蛋白VP区中包含单个突变的AAV颗粒的相当的多个细胞相比，所述多个细胞转导后转基因的表达增加约10倍至300倍。
111.一种制备工程化细胞的方法，其包括使多个细胞与有效量的腺相关病毒(AAV)颗粒接触，所述AAV颗粒编码转基因并且在衣壳蛋白的VP1区中包含第一突变并在VP3区中包含第二突变，从而产生多个工程化细胞，其中与接触野生型AAV颗粒或在所述衣壳蛋白VP区中包含单个突变的AAV颗粒的细胞相比，所述转基因在所述多个细胞中的表达增加，其中所述野生型AAV颗粒或在所述衣壳蛋白VP区中包含单个突变的AAV颗粒也编码所述转基因。
112.根据权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述转基因编码细胞受体或其部分。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述细胞受体或其部分是T细胞受体。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述细胞受体或其部分是嵌合抗原受体(CAR)。
115.根据权利要求109至114中任一项所述的方法，其中所述第一突变在由所述核酸编码的多肽的位置129处的F编码序列中。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述第一突变编码从所述多肽的第129位F突变为非极性脂族氨基酸的突变。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述非极性脂族氨基酸选自：亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述非极性脂族氨基酸是L。
119.根据权利要求109至118中任一项所述的方法，其中所述第一突变在所述多肽中的亮氨酸(L)编码序列中。
120.根据权利要求119所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·亨利，马维斯·阿格班德耶麦肯纳，蒂尔曼·布尔克斯图默尔，莉蒂亚·维尼，莫达希尔·乔杜里，
申请(专利权)人：因提玛生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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