一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法，包括以下步骤：确定AHR基因突变位点；根据突变位点设计并合成探针和引物；将被检测的AHR目标基因、探针、引物和酶混合进行荧光定量PCR，并监测荧光信号；计算杂交峰所显示的Tm值，根据Tm值判断AHR基因的类型。本发明专利技术操作简单，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。

【技术实现步骤摘要】
一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法
本专利技术涉及一种AHR基因多态性的检测方法，属于分子生物学

技术介绍
乳腺癌是女性健康的巨大“头号杀手”，全球每年有50万妇女死于这种癌症。该病大多数发生在40-60岁，即更年期前后的妇女。全世界乳腺癌发生率正以每年0.2％-3％的幅度上升，2012年新增乳腺癌发病数170万。在欧美等西方发达国家，乳腺癌已成为妇女的主要死因之一，每8-10名妇女中，就有1人在其一生中将患乳腺癌。在我国，乳腺癌的发病率也呈逐年上升的趋势，达到42.55/10万，在北京、上海、天津等大城市，乳腺癌已成为妇女恶性肿瘤发病的首位。散发性乳腺癌的发生不仅与个体遗传易感性有关，而且与某些环境因素如雌激素暴露水平、吸烟、婚育、哺乳、生活方式、饮食习惯等具有相关性。芳香烃受体(arylhydrocarbonreceptor，AHR)是一种配体激活转录因子，也是一种细胞信号通路的调节子。AHR可诱导许多外源化合物代谢酶的表达，还参与许多毒性反应和其他一些重要的生物学过程，如信号转导、细胞分化、细胞凋亡等。此外，AHR的基因多态性和化合物毒性作用与肿瘤易感性也有很重要的关系，在肿瘤的起始、进展和转移等过程中都起着重要作用。大量研究表明，活化的AHR可能参与了由多环芳烃诱导的乳腺癌的发生，而且AHR和细胞色素P4501B1可能成为乳腺癌的分子生物标记。AHR基因多态性的研究有利于建立对个体发生散发性乳腺癌风险的评估，以便于实现早期预防和治疗。目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。本专利技术利用一种可以特异识别核酸序列的荧光标记探针，通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简单易行的AHR基因多态性的检测方法。为了达到上述目的，本专利技术提供一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法，其特征在于，具体步骤为：第一步：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到10ng/ul；正常人样本DNA为阴性对照。第二步：根据AHR基因多态性rs2066853，设计合成探针序列及引物，探针区15～33bp，环序列与靶DNA序列互补，确定最佳引物为40-45bp大小，PCR产物长度100-150bp。相关探针及引物信息如下：rs2066853探针序列：探针15′-CY5-CCATTTTGAAGACATCAGACACATGCAGAATGG-BHQ2-3′rs2066853引物序列：引物15′-GCAACGGGTCACGTACGCAAGCAAATTGACCAGCCTCAGG-3′引物25′-GCAACGGGTCACGTACGCAAGTCTCTGAAGTCAACCTCACC-3′第三步：每个PCR反应的总体系为15ul(包括PCRMix7.5ul、正向引物溶液0.5ul及反向引物溶液0.5ul，探针0.1ul，样本DNA2ul，灭菌重蒸馏水4.4ul)；在荧光定量PCR检测系统SLAN-96P上进行反应，PCR反应条件为92-97℃预变性5-15分钟；92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，40-50个循环；72℃延伸10分钟；92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。第四步：应用SLAN软件分57℃为野生型，66℃为突变型。本专利技术对AHR基因多态性进行检测，可实现对AHR基因多态性的快速筛查，有利于建立对个体发生散发性乳腺癌的风险评估，以便于实现早期预防和治疗。本专利技术基于荧光标记探针技术，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例AHR基因为野生型纯合子样本检测结果示意图；图2是本专利技术实施例AHR基因为突变型纯合子样本检测结果示意图；图3是本专利技术实施例AHR基因为杂合子样本检测结果示意图；图4是多样本的溶解曲线图。具体实施方式实施例1：检测不同基因型标准品1、构建并制备含有目的基因位点的野生型标准品质粒和突变型标准品质粒。通过酶切及测序可以确定序列的准确性，野生型标准品质粒rs2066853基因型为AA；突变型标准品质粒rs2066853基因型为GG。标准品质粒DNA浓度标化到10ng/ul。2、采用在线软件Primer3设计引物，强化引物环序列与靶DNA序列互补，正向引物的序列为：5′-GCAACGGGTCACGTACGCAAGCAAATTGACCAGCCTCAGG-3′，反向引物的序列为：5′-GCAACGGGTCACGTACGCAAGTCTCTGAAGTCAACCTCACC-3′，探针的序列为5′-CY5-CCATTTTGAAGACATCAGACACATGCAGAATGG-BHQ2-3′。3、反应体系优化：1)探针量：分别设置0.01uM、0.05uM、0.1uM和0.5uM的探针量，其他条件保持不变，进行PCR实验。根据形成杂交峰的峰值高低以及峰型尖锐度综合考虑，确定使用0.1uM的探针量作为最终的体系用量。2)引物量：分别设置正反向引物量0.1uM、0.3uM、0.5uM和1.0uM，其他条件保持不变，进行PCR实验。根据扩增结果和探针杂交比对情况，发现引物量0.1-0.5uM时，杂交峰的峰值高低以及峰型尖锐度均无较大差异，确定使用0.3uM的引物量作为最终的体系用量。3)在每一个PCR反应孔中依次加入PCRMix7.5ul，正向引物溶液0.3uM及反向引物溶液0.3uM，探针0.1uM，然后在3个不同的PCR反应孔中分别加入野生型标准品质粒DNA、突变型标准品质粒DNA、混合型DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法，其特征在于， 所述SNP位点优选rs2066853，所述特异性引物：/n引物1 5′- GCAACGGGTCACGTACGCAAGCAAATTGACCAGCCTCAGG-3′；引物2 5′- GCAACGGGTCACGTACGCAAGTCTCTGAAGTCAACCTCACC- 3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法，其特征在于，所述SNP位点优选rs2066853，所述特异性引物：
引物15′-GCAACGGGTCACGTACGCAAGCAAATTGACCAGCCTCAGG-3′；引物25′-GCAACGGGTCACGTACGCAAGTCTCTGAAGTCAACCTCACC-3′。


2.权利要求1所述方法，其特征在于，所述探针为荧光探针：5′-CY5-CCATTTTGAAGACATCAGACACATGCAGAATGG-BHQ2-3′，荧光基团选CY5；淬灭基团选BH...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛丹丹，张奕，黄芬芬，
申请(专利权)人：上海中优精准医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31