STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法，首先构建STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体，并转染到供体小鼠受精卵，之后移植到假孕母鼠的子宫中生产出嵌合体小鼠；嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得F1代；将所述F1代与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合小鼠；将所述双杂合小鼠与STAT3

【技术实现步骤摘要】
STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法。
技术介绍
基因敲入是指对一个结构已知但功能有待阐明的基因，从分子水平上设计实验，将该基因体内过表达，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。信号转导与转录激活因子3(STAT3)是一类发挥信号转导和转录因子调节作用的蛋白质家族中的一员，其可以作为信号转导分子和转录调节因子参与到细胞因子和生长因子对于正常细胞的调控作用中。越来越多的研究显示，异常活化的STAT3和多种人类恶性肿瘤密切相关。抑制STAT3的过度的表达为治疗肿瘤的手段之一。此外，STAT3同时介导了炎症因子的表达和相应的免疫应答。近年来研究发现，STAT3活化后不仅定位于细胞核，而且一部分STAT3活化后定位于线粒体，调控能力代谢与线粒体DNA转录。然而，STAT3线粒体定位后的功能及分子机制尚未完全阐明。因此，构建条件性基因敲入小鼠模型为研究STAT3在炎症因子表达和相应的免疫应答，特定细胞发育分化，已经肿瘤形成中的作用至关重要。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法。利用本专利技术的构建方法可以使得STAT3基因在特定组织和细胞类型中过表达，为有目的的研究STAT3线粒体定位在在特定细胞发育与分化、机体代谢及肿瘤发生发展中的作用机制提供理想模型。本专利技术所采用的技术方案为：>一种STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：(1)构建STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体；(2)将所述重组打靶载体、Cas9mRNA和gRNA转染到供体小鼠受精卵中；(3)将所述受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，生产出F0代小鼠；对所述F0代小鼠进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；(4)将所述嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得后代小鼠并进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；(5)将所述F1代小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合小鼠；(6)将所述双杂合小鼠与STAT3f/+或STAT3f/f小鼠互交，获得的后代给予诱导，得到所述STAT3线粒体定位的条件性基因敲入小鼠。进一步地，步骤(1)中，所述构建STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体，具体操作如下：合成Cox4singal-STAT3基因，之后通过同源重组的方式将所述Cox4singal-STAT3基因在Rosa26基因位点定点插入得到CAG-LSL-Cox4singal-STAT3-WPRE-pA表达框，进而获得所述STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体；进一步地，所述重组打靶载体包含3.3kb5’同源臂、CAG-LSL-Cox4singal-STAT3-WPRE-pA和3.3kb3’同源臂。进一步地，步骤(2)中，与所述重组打靶载体同时转染到小鼠受精卵中的还有Cas9mRNA和gRNA。进一步地，所述gRNA序列为5’-GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG-3’，如SEQIDNO:1所示。进一步地，步骤(2)中，所述供体小鼠为C57BL/6J小鼠；步骤(3)中，所述假孕母鼠为C57BL/6J小鼠。进一步地，步骤(3)中，所述对F0代小鼠鉴定采用的为PCR鉴定方法；所述PCR鉴定方法采用的引物序列为I：5’-GCCGGGCCTCGTCGTCTG-3’和II：5’-TGAGGGCAATCTGGGAAGGTT-3’，如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；所述PCR鉴定方法的反应条件为：94℃3min，98℃15s，60℃15s，68℃3min，68℃5min，共35个循环。进一步地，5’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.4kb片段，阴性基因组应扩增出5.1kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.6kb片段，阴性基因组应扩增出6.5kb片段。进一步地，步骤(4)中，所述对F1代鉴定采用的为PCR鉴定方法。进一步地，所述PCR鉴定方法采用的5’臂的引物序列为p1：5’-TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA-3’和p2：5’-TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA-3’，如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；反应条件为：94℃5min，94℃15s，58℃15s，72℃1min，72℃5min，共35个循环；5’臂基因组扩增出994bp片段。进一步地，所述PCR鉴定方法采用的3’臂的引物序列为p3：5’-GCGTATCCACATAGCGTAAAAGG-3’和p4：5’-TACCCCGACATTCCCAAGG-3’，如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示，3’臂阳性基因组应扩增出414bp片段，PCR反应条件为：94℃5min，94℃15s，58℃15s，72℃1min，72℃5min，共35个循环。进一步地，步骤(4)中，所述F1代小鼠为表达STAT3f/+的杂合小鼠。进一步地，步骤(5)中，所述组织特异性表达Cre重组酶的小鼠为表达ERT2Cre+或UbcERT2Cre+的小鼠，所述双杂合小鼠为表达STAT3f/+；Cre+的小鼠。进一步地，步骤(6)中，所述后代为表达STAT3f/f；Cre+的小鼠，所述给予诱导为给予他莫昔芬诱导，所述他莫昔芬的用量为0.5μM/g体重，连续给药5天。插入位点基因名称(Ensembl)：Gt(ROSA)26Sor(ENSMUSG00000086429)插入位点染色体位置(Ensembl)：Chromosome6:113,076,031插入目的基因名称：STAT3，GeneID:20848线粒体定位信号肽序列：酵母菌氧化酶复合物4(Cox4)ATGTTGTCTAGATATCTGCTTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACAATCAAGGAATTCACAATGTTGTCTAGATATCTGCTTCAGCAAAAACCCGTGGTGAAAACTGCCCAAAACTTAGCAGAAGTTAATGGTCCAGAAACTTTGATTGGTCCTGGTGCTAAAGAGGGTACCGTTCCAACAGACCTAGATCAAGAAACTGGTTTAGCTAGGTTAGAATTATTGGGTAAATTAGAGGGTATCGAT。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的STAT3线粒体定位条件性基因敲入的小鼠模型的构建方法，通过同源重组的方式，在Rosa26基因位点定点插入CAG-LSL-Cox4singal-STAT3-WPRE-pA表达框构建同源重组载体。将Cas9mRNA、gRNA和同源重组载体显微注本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)构建STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体；/n(2)将所述重组打靶载体、Cas9 mRNA和gRNA转染到供体小鼠受精卵中；/n(3)将所述受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，生产出F0代小鼠；对所述F0代小鼠进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；/n(4)将所述嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得后代小鼠并进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；/n(5)将所述F1代小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配可获得双杂合小鼠；/n(6)将所述双杂合小鼠与STAT3

【技术特征摘要】
1.一种STAT3线粒体定位条件性基因敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体；
(2)将所述重组打靶载体、Cas9mRNA和gRNA转染到供体小鼠受精卵中；
(3)将所述受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，生产出F0代小鼠；对所述F0代小鼠进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；
(4)将所述嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得后代小鼠并进行鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；
(5)将所述F1代小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配可获得双杂合小鼠；
(6)将所述双杂合小鼠与STAT3f/+或STAT3f/f小鼠互交，获得的后代给予诱导，得到所述STAT3线粒体定位的条件性基因敲入小鼠。


2.根据权利要求1所述的STAT3线粒体定位条件性基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建STAT3线粒体定位条件性基因敲入的重组打靶载体，具体操作如下：
合成Cox4singal-STAT3基因，之后通过同源重组的方式将所述Cox4singal-STAT3基因在Rosa26基因位点定点插入得到CAG-LSL-Cox4singal-STAT3-WPRE-pA表达框，进而获得所述STAT3线粒体定位的条件性基因敲入的重组打靶载体；
所述重组打靶载体包含3.3kb5’同源臂、CAG-LSL-Cox4singal-STAT3-WPRE-pA和3.3kb3’同源臂。


3.根据权利要求1所述的STAT3线粒体定位条件性基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，与所述重组打靶载体同时转染到小鼠受精卵中的还有Cas9mRNA和gRNA。


4.根据权利要求3所述的STAT3线粒体定位条件性基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述gRNA序列为5’-GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG-3’，如SEQIDNO:1所示。


5.根据权利要求1所述的STAT3线粒体定位条件性基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述供体小鼠为C57BL/6J小鼠；步骤(3)中，所述假孕母鼠为C57BL/6J小鼠。


6.根据权利要求1所述的STAT3线粒体定位条件性基因敲入的小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晶，陈欣，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32