一种晚期雄性生殖细胞报告系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种晚期雄性生殖细胞报告系统及其应用。本发明专利技术首先公开了一种DNA分子，即晚期雄性生殖细胞报告系统，包括荧光蛋白基因、位于荧光蛋白基因上游的TEKT1基因的启动子和位于荧光蛋白基因下游的TEKT1基因的3’UTR。本发明专利技术进一步公开了上述DNA分子在作为晚期雄性生殖细胞的指示标记中的应用。本发明专利技术将晚期雄性生殖细胞报告系统导入离体干细胞的基因组后进行诱导分化，借助该系统可以在荧光显微镜下实时跟踪晚期雄性生殖细胞的生成，并利用流式细胞分选术将晚期雄性生殖细胞进行分离，对改进现有体外分化系统以及未来治疗不孕不育等疾病均具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种晚期雄性生殖细胞报告系统及其应用
本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及利一种晚期雄性生殖细胞报告系统及其应用。
技术介绍
根据世界卫生组织的统计，不孕不育困扰着世界上15％左右的夫妇。其中，男性因素占据40％-60％的比重，具体反映在精细胞数量或者质量的缺陷上。人类多能性干细胞，具有分化为人体各种细胞类型的潜力，体外分化干细胞为有功能的精细胞，为不孕不育的治疗提供了一种切实可行的途径。受分化效率等方面的制约，体外分化得到的生殖细胞群，往往会包含不同发育阶段的生殖细胞以及混杂着许多其他的细胞类型。如何将生殖细胞从混杂细胞群中分化出来，目前还缺少有效、可行的途径，是体外分化系统亟需解决的一个难点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为如何指示体外分化系统中获得的晚期雄性生殖细胞。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种DNA分子，即晚期雄性生殖细胞报告系统，即TEKT1:GFP-3’UTR报告系统。本专利技术所提供的DNA分子包括荧光蛋白基因、位于荧光蛋白基因上游的TEKT1基因的启动子和位于荧光蛋白基因下游的TEKT1基因的3’UTR。上述DNA分子中，所述荧光蛋白基因可为绿色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。上述DNA分子中，所述TEKT1基因的启动子的核苷酸序列可为包含SEQIDNO.1的序列。具体的，所述TEKT1基因的启动子的核苷酸序列可为SEQIDNO.1所示序列。上述DNA分子中，所述TEKT1基因的3’UTR的核苷酸序列可为包含SEQIDNO.2的序列。具体的，所述TEKT1基因的3’UTR的核苷酸序列可为SEQIDNO.2所示序列。上述DNA分子中可通过同源重组、酶切连接、无缝连接等方法将TEKT1基因启动子的核苷酸序列置于荧光蛋白基因的起始密码子(通常为ATG)的上游，使得所述TEKT1基因的启动子可以启动荧光蛋白基因的表达；将TEKT1基因的3’UTR置于荧光蛋白基因的下游，以增强启动子的效果和特异性。本专利技术包含上述DNA分子的重组载体、重组病毒、重组菌或重组细胞也在本专利技术的保护范围之内。在本专利技术具体的实施方式中，所述重组载体为慢病毒载体x，具体的制备方法可为：向pENTR/1A质粒的多克隆位点插入荧光蛋白基因-3’UTR(所述荧光蛋白基因-3’UTR是在SEQIDNO.2所示的TEKT1基因的3’UTR的上游连接相应的荧光蛋白基因得到)，得到载体pENTR/1A-荧光蛋白基因-3’UTR；向pENTR/5’topo质粒的多克隆位点插入SEQIDNO.1所示的DNA分子(即TEKT1启动子的核苷酸序列)，得到载体pENTR/5’topo-TEKT1；将载体pENTR/1A-荧光蛋白基因-3’UTR、载体pENTR/5’topo-TEKT1和慢病毒质粒p2K7-NEO通过同源重组制备慢病毒载体x。具体的所述多克隆位点为限制性内切酶EcoRI的识别位点。在本专利技术具体的实施方式中，所述重组病毒为重组慢病毒X，具体的制备方法为可将慢病毒载体x、慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9、vsvg共转染293FT细胞，获得重组慢病毒x。在本专利技术具体的实施方式中，所述重组细胞为含TEKT1:GFP-3’UTR报告系统H1干细胞或者其他类型的体细胞，具体的制备方法为：用含TEKT1:GFP-3’UTR报告系统的重组慢病毒侵染干细胞或者其他类型的体细胞获得。本专利技术SEQIDNO.1所示的DNA分子(即TEKT1基因的启动子)及包含SEQIDNO.1所示的DNA分子的重组载体、重组病毒、重组菌或重组细胞也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术SEQIDNO.2所示的DNA分子(即TEKT1基因的3’UTR)及包含SEQIDNO.2所示的DNA分子的重组载体、重组病毒、重组菌或重组细胞也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术进一步提供了上述DNA分子及其重组载体、重组病毒、重组菌或重组细胞在如下任一中的应用：1)作为晚期雄性生殖细胞的指示标记；2)作为晚期雄性生殖细胞的分离标记；3)作为晚期雄性生殖细胞的富集标记；4)制备晚期雄性生殖细胞。在本专利技术具体的实施方式中，作为晚期雄性生殖细胞的指示标记的应用具体可为制备晚期雄性生殖细胞中，例如向离体的干细胞或成纤维细胞导入上述DNA分子，对导入上述DNA分子的干细胞或成纤维细胞进行诱导分化培养得到培养物，待培养物中观察到荧光阳性细胞的生成，即表明生成了晚期雄性生殖细胞，可从培养物中分离晚期雄性生殖细胞。其中，所述干细胞可为胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。具体的，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞。在本专利技术具体的实施方式中，所述向干细胞导入上述DNA分子可采用重组慢病毒X侵染实现。所述重组慢病毒X可为慢病毒载体x包装而成。具体的，可将慢病毒载体x、慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9、vsvg共转染293FT细胞，获得重组慢病毒x。所述慢病毒载体x的制备方法可为：向pENTR/1A质粒的多克隆位点插入荧光蛋白基因-3’UTR，得到载体pENTR/1A-荧光蛋白基因-3’UTR(在SEQIDNO.2所示的TEKT1基因的3’UTR的上游连接相应的荧光蛋白基因得到)；向pENTR/5’topo质粒的多克隆位点插入SEQIDNO.1所示的DNA分子(TEKT1启动子的核苷酸序列)，得到载体pENTR/5’topo-TEKT1；将载体pENTR/1A-荧光蛋白基因-3’UTR、载体pENTR/5’topo-TEKT1和慢病毒质粒p2K7-NEO通过同源重组制备慢病毒载体x。具体的，所述多克隆位点为限制性内切酶EcoRI的识别位点。本专利技术通过克隆TEKT1基因长约2KB的启动子和TEKT1基因的3’UTR，并将TEKT1基因的3’UTR连接在荧光蛋白的下游后连接在TEKT1基因的启动子下游，可获得TEKT1:GFP-3’UTR报告系统。将该TEKT1:GFP-3’UTR报告系统以病毒介导的方式导入离体干细胞的基因组后进行诱导分化，可以准确地指示体外分化系统中获得的晚期雄性生殖细胞，借助该TEKT1:GFP-3’UTR报告系统，可以在荧光显微镜下实时跟踪晚期雄性生殖细胞的生成，并利用流式细胞分选术将晚期雄性生殖细胞进行分离。因此，TEKT1:GFP-3’UTR报告系统对改进现有体外分化系统以及未来治疗不孕不育等疾病均具有重要的意义。附图说明图1为TEKT1:GFP-3’UTR报告系统构造图。图2为导晚期雄性生殖细胞的流程示意图。图3为分化结束形成的TEKT1:GFP+阳性细胞分群。图4为流式分析显示分化结束后的细胞中有明显的GFP阳性分群。图5为转录本分析显示TEKT1:GFP+阳性细胞表达明显的晚期生殖细胞标记。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括荧光蛋白基因、位于所述荧光蛋白基因上游的TEKT1基因的启动子和位于所述荧光蛋白基因下游的TEKT1基因的3’UTR。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括荧光蛋白基因、位于所述荧光蛋白基因上游的TEKT1基因的启动子和位于所述荧光蛋白基因下游的TEKT1基因的3’UTR。


2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述TEKT1基因的启动子的核苷酸序列为包含SEQIDNO.1的序列。


3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于：所述TEKT1基因的3’UTR的核苷酸序列为包含SEQIDNO.2的序列。


4.根据权利要求1-3任一所述的DNA分子，其特征在于：所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因。


5.SEQIDNO.1所示的DNA分子或SEQIDNO.2所示的DNA分子。

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【专利技术属性】
技术研发人员：梁健霖，纪家葵，
申请(专利权)人：华卫恒源北京生物医药科技有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11