微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法技术

本发明专利技术公开了微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：步骤S1、菌株预处理，步骤S2、菌株诱变，步骤S3、种子罐培育，步骤S4、发酵罐培育，步骤S5、放罐，步骤S6、酶提取；本发明专利技术的有益效果是，利用如上方法制备的葡萄糖氧化酶，通过在种子罐培养前，利用加入诱变剂的方式配合温度逐级降低的方式，培养出具有低温活性好的菌株，使得所得酶活更适于在低温环境中活跃运动，而通过诱变的方式加速这一过程，使得生产效率大大提高，不仅得到了低温酶活好的菌株而且缩短了菌株向低温活性转换的时间，生产效率因此大大提高。

【技术实现步骤摘要】
微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法
本专利技术涉及微生物发酵
，特别是微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法。
技术介绍
葡糖氧化酶简称GOD是食品工业中一种重要的工业用酶，广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脱氧、面粉改良、防止食品褐变等方面，在食品快速检测及生物传感器上也有广泛应用。葡萄糖氧化酶在自然界广泛存在，但是提取难度较大；现有的加工工艺也多是通过微生物发酵的方式进行生产，而申请号为CN201510084670.0的专利中指出了低温葡萄糖氧化酶的优势，由于低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率,可大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质，基于上述优点低温葡萄糖氧化酶对比现有的常温葡萄糖氧化酶具有较大优势，因而培养低温葡萄糖氧化酶是一种经济实惠的发展方向；而申请号为CN201510084670.0的专利中指出的氧化酶培养方法，虽然能够培养出适应低温的低温葡萄糖氧化酶，但是其驯化过程中，首先没有添加相应的诱导剂，致使产生菌株的速率较慢，影响生产速率，其次菌株的驯化率低，产品的成品率低，不是特别适合批量生产制备，鉴于此，针对上述问题深入研究，遂有本案产生。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，设计了微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，解决了现有的氧化酶培养方法，驯化过程中，首先没有添加相应的诱导剂，致使产生菌株的速率较慢，影响生产速率，其次菌株的驯化率低，产品的成品率低，不是特别适合批量生产制备。实现上述目的本专利技术的技术方案为：微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：步骤S1、菌株预处理，步骤S2、菌株诱变，步骤S3、种子罐培育，步骤S4、发酵罐培育，步骤S5、放罐，步骤S6、酶提取；S1：将产黄青霉菌株斜面上的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡30～40min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球计数板进行计数，稀释成100个/ml的孢子悬液；S2：首先进行磷酸二丁酯诱变：取5ml孢子悬液加入到体积为25ml的三角瓶中，再加入0.2ml的硫酸二丁酯(体积浓度50％)，振荡不同时间，再加入0.5ml的硫代硫酸钠(85％)终止反应，稀释梯度为10-1～10-6，取各剂量的(10-4～10-6)3个梯度的孢子悬液0.2ml，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养1～2d，计算菌落数，绘制致死率曲线，挑取筛选平板上蓝色圈较大的单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生；其次进行低温诱变：取5ml的孢子悬液，加入到体积为25ml的三角瓶中，再瓶内不断加入冰块，经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃至25℃至20℃至15℃至10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活，选取酶活高的菌株进行保存；培养完成后，筛选出具有活化性高低温活性好的菌株；S3：罐压0.1-0.12MPa，培养温度25-20℃，通风量32-35m3/h，搅拌转速60-120r/min，pH控制6.0-6.5；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养；S4：罐压0.1-0.12Mpa，培养温度20-15℃，搅拌转速240-270r/min，pH控制5.0-6.0；通风量：0-20h为32-35m3/h，20-22h为38-40m3/h，22h-放罐为25-30m3/h；当pH升至6.0时，开始补料，控制pH在5.0-6.0；S5：发酵罐培养至48-78h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；S6：将发酵液在4000～8000rpm离心收集液体，收集到的上清液即为粗酶液，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡萄糖氧化酶制剂。所述步骤S2中进行磷酸二丁酯诱变时采用的平板培养基(葡萄糖12％、NaNO31％、K2HPO41.5％、KCl0.1％、MgSO40.1％、琼脂3％-4％；)。所述步骤S2中进行低温诱变的液体培养基(葡萄糖12％、CaCO31-5％、KI0.5％、磷酸二丁酯0.5mol/L、琼脂3-4％，pH6.0)。所述步骤S3中种子罐培养基(葡萄糖25％，蛋白胨20％，CaCO35％，KI1％，MgSO40.8％，pH6.5)。所述步骤S3中培养温度优选采用20℃，通风量35m3/h，搅拌转速90r/min。所述步骤S4发酵罐培养基(蔗糖24％、蛋白胨1％、CaCO31％、K2HPO40.5％、KCl0.5％、MgSO40.2％、NaNO32％，pH6.5)。所述步骤S4中培养温度优选采用15℃，搅拌转速240r/min。所述步骤S5中放罐培养至72h。所述步骤S4中补料培养基(蔗糖25％，玉米浆20％，KCl1％，pH5.5)。所述步骤S6中离心机离心速率优选在5000～6000rpm。利用本专利技术的技术方案制作的名称，有益效果。具体实施方式本实施方案的特点为，包括以下步骤：步骤S1、菌株预处理，步骤S2、菌株诱变，步骤S3、种子罐培育，步骤S4、发酵罐培育，步骤S5、放罐，步骤S6、酶提取；S1：将产黄青霉菌株斜面上的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡30～40min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球计数板进行计数，稀释成100个/ml的孢子悬液；S2：首先进行磷酸二丁酯诱变：取5ml孢子悬液加入到体积为25ml的三角瓶中，再加入0.2ml的硫酸二丁酯(体积浓度50％)，振荡不同时间，再加入0.5ml的硫代硫酸钠(85％)终止反应，稀释梯度为10-1～10-6，取各剂量的(10-4～10-6)3个梯度的孢子悬液0.2ml，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养1～2d，计算菌落数，绘制致死率曲线，挑取筛选平板上蓝色圈较大的单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生；其次进行低温诱变：取5ml的孢子悬液，加入到体积为25ml的三角瓶中，再瓶内不断加入冰块，经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃至25℃至20℃至15℃至10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活，选取酶活高的菌株进行保存；培养完成后，筛选出具有活化性高低温活性好的菌株；S3：罐压0.1-0.12MPa，培养温度25-20℃，通风量32-35m3/h，搅拌转速60-120r/min，pH控制6.0-6.5；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养；S4：罐压0.1-0.12Mpa，培养温度20-15℃，搅拌转速240-270r/min，pH控制5.0-6.0；通风量：0-20h为32-35m3/h，20-22h为38-40m3/h，22h-放罐为25-30m3/h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、菌株预处理，步骤S2、菌株诱变，步骤S3、种子罐培育，步骤S4、发酵罐培育，步骤S5、放罐，步骤S6、酶提取；/nS1：将产黄青霉菌株斜面上的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡30～40min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球计数板进行计数，稀释成100个/ml的孢子悬液；/nS2：首先进行磷酸二丁酯诱变：取5ml孢子悬液加入到体积为25ml的三角瓶中，再加入0.2ml的硫酸二丁酯(体积浓度50％)，振荡不同时间，再加入0.5ml的硫代硫酸钠(85％)终止反应，稀释梯度为10-1～10-6，取各剂量的(10-4～10-6)3个梯度的孢子悬液0.2ml，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养1～2d，计算菌落数，绘制致死率曲线，挑取筛选平板上蓝色圈较大的单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生；/n其次进行低温诱变：取5ml的孢子悬液，加入到体积为25ml的三角瓶中，再瓶内不断加入冰块，经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃至25℃至20℃至15℃至10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活，选取酶活高的菌株进行保存；培养完成后，筛选出具有活化性高低温活性好的菌株；/nS3：罐压0.1-0.12MPa，培养温度25-20℃，通风量32-35m...

【技术特征摘要】
1.微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、菌株预处理，步骤S2、菌株诱变，步骤S3、种子罐培育，步骤S4、发酵罐培育，步骤S5、放罐，步骤S6、酶提取；
S1：将产黄青霉菌株斜面上的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡30～40min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球计数板进行计数，稀释成100个/ml的孢子悬液；
S2：首先进行磷酸二丁酯诱变：取5ml孢子悬液加入到体积为25ml的三角瓶中，再加入0.2ml的硫酸二丁酯(体积浓度50％)，振荡不同时间，再加入0.5ml的硫代硫酸钠(85％)终止反应，稀释梯度为10-1～10-6，取各剂量的(10-4～10-6)3个梯度的孢子悬液0.2ml，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养1～2d，计算菌落数，绘制致死率曲线，挑取筛选平板上蓝色圈较大的单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生；
其次进行低温诱变：取5ml的孢子悬液，加入到体积为25ml的三角瓶中，再瓶内不断加入冰块，经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30℃至25℃至20℃至15℃至10℃，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活，选取酶活高的菌株进行保存；培养完成后，筛选出具有活化性高低温活性好的菌株；
S3：罐压0.1-0.12MPa，培养温度25-20℃，通风量32-35m3/h，搅拌转速60-120r/min，pH控制6.0-6.5；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养；
S4：罐压0.1-0.12Mpa，培养温度20-15℃，搅拌转速240-270r/min，pH控制5.0-6.0；通风量：0-20h为32-35m3/h，20-22h为38-40m3/h，22h-放罐为25-30m3/h；当pH升至6.0时，开始补料，控制pH在5.0-6.0；
S5：发酵罐培养至48-78h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；
S6：将发酵液在4000～8000rpm离心收集液体，收集到的上清液即为粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保全，谢燕霞，李常云，崔学儒，
申请(专利权)人：宏葵生物中国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37