本发明专利技术属于抗原制备工艺的技术领域，具体涉及一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的该冠状病毒融合蛋白通过将2019‑nCoV S蛋白RBD结构域核苷酸序列和2019‑nCoV N蛋白核苷酸序列全基因合成后构建至昆虫细胞表达载体中，制备得到含有2019‑nCoV N蛋白和2019‑nCoV S蛋白RBD结构域序列的重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌后获得含有上述融合蛋白基因序列的重组杆粒，重组杆粒转染宿主细胞，进而完成2019‑nCoV N蛋白和2019‑nCoV S蛋白RBD结构域的融合表达。该种融合蛋白的表达过程简单，同时将融合蛋白用于2019‑nCoV抗体检测试剂盒时不仅显著地提高了检测试剂盒的灵敏度，而且也提高了特异性，检出率得到了高效地提升，整体使用性能更为优化。
【技术实现步骤摘要】
一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术属于抗原制备工艺的
，具体涉及一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎(CoVID-19)是一种新型冠状病毒，WHO命名为2019-nCoV。冠状病毒是一个大型病毒家族，可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病，而2019-nCoV是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。2019-nCoV属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm，其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显区别。研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。2019-nCoV是一类单股正链RNA冠状病毒，其主要结构蛋白有刺突蛋白(spikeprotein，S蛋白)，核衣壳蛋白(nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(membraneprotein，M蛋白)，包膜蛋白(envelopeprotein，E蛋白)。病毒要进入细胞，细胞上就必须有它对应的受体，S蛋白可与宿主细胞的病毒受体结合，是决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白。该病毒传染性强，目前在全球主要人口集中区均有发现，已成全球流行趋势。随着最新版新型冠状病毒诊疗方案(试行第七版)的施行，血清新型冠状病毒特异性抗体IgG和IgM的检测技术也列入确诊手段。结合磁微粒化学发光免疫检测技术能高效，快速，安全的检测新冠病毒特异性抗体，为早期疾病的筛查，疾病的确诊，预后的跟踪等提供依据，新冠病毒特异性抗体IgM/G检测试剂盒的研发将有利于疫情的防控。目前新冠病毒的检测方法主要是病毒核酸RNA的荧光定量PCR检测技术，疫情发生以来普通实时定量荧光PCR核酸检测发挥了重要作，但是该检测手段同时也存在一些问题包括检测阳性率低，约30-50％，假阴性，耗时较长，检测结果具有很大的不确定性；样本采集相对困难，有气溶胶污染风险，对于医护人员是严重的威胁。因此，高检测准确度、灵敏度和检出率的新冠病毒特异性抗体IgM/G磁微粒化学发光检测试剂盒的开发不仅应能为国家和世界的新冠疫情防控助力，具有重要的社会效益；同时试剂盒的产业化也能促进现代生物技术行业的进步与显著地发展。因此，作为新冠病毒特异性抗体IgM/G磁微粒化学发光检测试剂盒的主要原材料之一的病毒重组抗原，将占据免疫检测试剂盒开发的大量成本。该种融合蛋白用于2019-nCoV抗体检测试剂盒时不仅显著地提高了检测试剂盒的灵敏度，而且也提高了特异性，检出率得到了高效地提升，整体使用性能更为优化。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用。本专利技术所采用的技术方案为：一种冠状病毒融合蛋白，该冠状病毒融合蛋白包括2019-nCoVS蛋白区段和2019-nCoVN蛋白区段，2019-nCoVS蛋白区段具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，2019-nCoVN蛋白区段具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。优选地，冠状病毒融合蛋白具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。一种冠状病毒融合蛋白的制备方法，该制备方法包括：S1：重组包含2019-nCoVS蛋白区段的核苷酸序列和2019-nCoVN蛋白区段核苷酸序列的全基因合成序列，将上述全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；S2：将步骤S1中的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组杆粒；S3：将步骤S2中的重组杆粒转染细胞，进行表达；S4：将步骤S3中表达得到的细胞培养物进行筛选、纯化，获得融合蛋白。全基因合成，是一种依照某一蛋白的氨基酸序列，或基因序列，设计全长引物，利用OVERLAP方法形成模板DNA，再利用PCR扩增的方法得到双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体或者表达载体中。该种合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法，同时可以依据密码子在不同宿主细胞的偏爱性、不同的实验需求以及对于引物设计时涉及的顺序问题等，来设计基因序列，进而提高表达水平的一种方法。优选地，步骤S1中重组包含2019-nCoVS蛋白区段的核苷酸序列和2019-nCoVN蛋白区段核苷酸序列的全基因合成序列时，采用柔性连接子将2019-nCoVS蛋白区段的核苷酸序列和2019-nCoVN蛋白区段的核苷酸序列连接。优选地，柔性连接子包括Linker连接子。优选地，Linker连接子具有如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列表达。优选地，2019-nCoVS蛋白区段的核苷酸序列包括2019-nCoVS蛋白RBD结构域的核苷酸序列。结构域，是生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特指蛋白质中这样的区域。在球形蛋白中，结构域具有自己特定的三级结构，其功能不依赖于蛋白质分子中的其余部分，但是同一蛋白质中不同结构域间常可通过不具二级结构的短序列连接起来。蛋白质分子中不同的结构域常由基因的不同外显子所编码。2019-nCoVS蛋白RBD结构域是2019-nCoVS蛋白的306-527氨基酸序列。优选地，步骤S1中的表达载体包括昆虫细胞表达载体和/或杆状病毒表达载体。昆虫细胞表达载体和/或杆状病毒表达载体，用于表达蛋白质的多角体强启动子，简化克隆的三个读码框，轻松纯化重组融合蛋白的N-端6xHis标签，在蛋白质纯化后去除组氨酸标签的TEV蛋白酶切割位点。优选地，步骤S2中的宿主细胞包括大肠杆菌宿主和/或动物性细胞宿主。一种冠状病毒融合蛋白的应用，利用上述冠状病毒融合蛋白在2019-nCoV抗体检测试剂盒、疫苗、抗体和诊断抗原应用中的一种或多种。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种冠状病毒融合蛋白，其是通过将2019-nCoVS蛋白RBD结构域核苷酸序列和2019-nCoVN蛋白核苷酸序列全基因合成后构建至昆虫细胞表达载体中，制备得到含有2019-nCoVN蛋白和2019-nCoVS蛋白RBD结构域序列的重组质粒，该重组质粒转化大肠杆菌后获得含有上述融合蛋白基因序列的重组杆粒，重组杆粒转染宿主细胞，进而完成2019-nCoVN蛋白和2019-nCoVS蛋白RBD结构域的融合表达。该种融合蛋白的表达过程简单，同时将融合蛋白用于2019-nCoV抗体检测试剂盒时不仅显著地提高了检测试剂盒的灵敏度，而且也提高了特异性，检出率得到了高效地提升，整体使用性能更为优化。附图说明图1是本专利技术实施例2中冠状病毒融合蛋白表达载体的多克隆位点示意图；图2是本专利技术实施例4中冠状病毒融合蛋白通过SDS-PAGE电泳的电泳条带图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种冠状病毒融合蛋白，其特征在于，所述冠状病毒融合蛋白包括2019-nCoV S蛋白区段和2019-nCoV N蛋白区段，所述2019-nCoV S蛋白区段具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达，2019-nCoV N蛋白区段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。/n
【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒融合蛋白，其特征在于，所述冠状病毒融合蛋白包括2019-nCoVS蛋白区段和2019-nCoVN蛋白区段，所述2019-nCoVS蛋白区段具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列表达，2019-nCoVN蛋白区段具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列表达。
2.根据权利要求1所述的一种冠状病毒融合蛋白，其特征在于，所述冠状病毒融合蛋白具有如SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的一种冠状病毒融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1：重组包含2019-nCoVS蛋白区段的核苷酸序列和2019-nCoVN蛋白区段核苷酸序列的全基因合成序列，将上述全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；
S2：将步骤S1中的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组杆粒；
S3：将步骤S2中的重组杆粒转染细胞，进行表达；
S4：将步骤S3中表达得到的细胞培养物进行筛选、纯化，获得融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种冠状病毒融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中重组包含2019-nCoVS蛋白区段的核苷酸序列和2019-nCoVN蛋白区段核苷酸序列的全基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦枫，潘敬梅，黄敬双，张伟，万文琴，鲜静，吴斌，张小飞，季纯宇，颜松，
申请(专利权)人：四川携光生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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