一种三联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种变异株法氏囊病毒FJ19株，用该毒株的VP2蛋白制备三联灭活疫苗的方法及相应疫苗。疫苗包括来源于变异株FJ19株(保藏编号为CGMCC NO：19381)的VP2蛋白、鸡新城疫La Sota病毒株和H9亚型禽流感TL18株(保藏编号号为：CGMCC NO：19382)。本发明专利技术三联疫苗可一针防治三病，免疫原性好，持续期长，安全性能好；特别地，疫苗中VP2蛋白含量高，甲醛和内毒素含量低，对当前流行的FJ19变异株法氏囊病毒具有较好的保护效果，免疫剂量小，免疫效果好，能够有效提高鸡群保护率。

【技术实现步骤摘要】
一种三联灭活疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物兽药
，具体涉及一种新型鸡新城疫、传染性法氏囊、禽流感三联灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害全球养禽业最为严重的烈性传染病之一。OIE将其列为A类疫病，是我国《国家中长期动物疫病防治规划》中规定优先防治和重点防范的5种一类动物疫病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病。Lasota为常见的新城疫毒株。禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)感染禽类引起的一类传染病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很大。禽流感H9亚型数与低致病性禽流感，在养殖场的发病率比较高，发病症状不太明显，但对鸡肠道和输卵管等影响非常大。鸡传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起的一种危害青年鸡的烈性、高度接触性、病毒性传染病，主要侵害鸡法氏囊。传染性法氏囊(IBD)是最为重要的免疫抑制性疾病之一，导致感染鸡较高的发病率和病死率。在过去的几十年中，我国临床流行的法氏囊以超强毒(vvIBDV)和中等毒力的法氏囊病毒为主，传染性法氏囊病毒(IBDV)变异株却从未引起大家的重视。目前使用的IBD疫苗包括中等毒力的弱毒苗、全病毒灭活疫苗以及基因工程疫苗，但在有的地区免疫过IBD疫苗的鸡群中仍然有IBD的发生，提示IBDV的感染和传播对我国IBD的防控仍然构成威胁。最近，我国多个地区养殖场发生疑似IBD的亚临床感染症状，从发病鸡分离到IBDV，经研究确定分离株为IBDV的变异株。该病多发生在白羽肉鸡、817肉鸡；一年四季均可发生，以4-7月份多发；3-7周龄易感，最小可见16天鸡发病，感染途径包括消化道、呼吸道、眼结膜等，也可接触传播，其他可通过如饮水器具、食槽、尘土、人员、昆虫、运输车辆间接传播，带毒和发病鸡为主要传染源。目前还没有针对新型IBDV变异株和AI变异株的疫苗，而传统的疫苗不能对流行的变异株病毒提供保护。因此，研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的变异株IA和IBDV亚单位灭活疫苗对目前临床防控IBD具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的是针对上述现有技术的不足，提供一种三联灭活疫苗及其制备方法，抗原为灭活的鸡新城疫LaSota病毒株、灭活的H9亚型禽流感TL18株和灭活的变异株法氏囊病毒FJ19株VP2蛋白。TL18株，分类命名为A型禽流感病毒H9亚型，菌种保藏编号为CGMCCNO：19382于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。变异株法氏囊病毒FJ19株从发病白羽肉鸡群的法氏囊组织样品中分离得到，为国内新分离的病毒，所述毒株引起鸡的症状不同于目前的超强毒和经典株传染性法氏囊病毒，FJ19株，分类命名为禽双股RNA病毒，菌种保藏编号为CGMCCNo.19381，于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。优选地，变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白的核苷酸如SEQIDNO.1所示；氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。更优选地，所述鸡新城疫LaSota病毒株的含量≥108.5EID50/0.1mL；所述H9亚型禽流感TL18株的含量≥107.5EID50/0.1mL；所述变异株法氏囊病毒VP2蛋白含量的琼扩效价≥1:128。本专利技术还提供了灭活的鸡新城疫LaSota病毒株、灭活的H9亚型禽流感TL18株和灭活的变异株法氏囊病毒FJ19株VP2蛋白三联灭活疫苗的制备方法，包括了VP2蛋白的制备、油相制备、水相制备和乳化步骤，具体为：S1、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备：S101、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备扩增获得IBDVFJ19株的VP2蛋白，与pMD相连，获得pMD-IBDV-VP2；S102、pFastBacI-IBDV-VP2中转质粒的制备：将pFastBacI质粒和S101中得到的pMD-IBDV-VP2重组质粒分别进行双酶切后连接获得pFastBacI-IBDV-VP2中转质粒；S103、重组杆粒rBac-IBDV-VP2的构建：将S102中得到的pFastBacI-IBDV-VP2中转质粒转入大肠杆菌DH10Bac中获得重组杆粒rBac-IBDV-VP2；S104、重组杆粒转染sf9细胞：将S103中得到的重组杆粒rBac-IBDV-VP2转染昆虫细胞sf9，培养获得重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代；S105、重组杆状病毒的扩增：将S104中得到的重组杆状病毒rBac-IBDV-VP2株F0代接种昆虫细胞sf9，培养得到F1代重组杆状病毒；S106、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的获得：将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，培养，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到变异株法氏囊病毒VP2蛋白。S2、油相制备：取注射用白油、硬脂酸铝混合加热后，加入司本80，继续加热，自然冷却至室温后，得到油相；S3、水相制备：将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的变异株法氏囊病毒VP2蛋白混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；S4、乳化：将S2中得到的油相放入乳化罐内，边搅拌边加入S3中得到的水相，得到乳化液，剪切，得到三联灭活疫苗。更优选地，变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备步骤为：S101、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备：设计适于杆状病毒表达系统表达VP2蛋白核酸序列的引物对，分别命名为VP2-P1和VP2-P2，所述VP2-P1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述VP2-P2的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；以提取的变异株IBDVFJ19株总RNA的反转录产物cDNA为模板，以VP2-P1和VP2-P2为引物，进行PCR扩增，得到VP2目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收VP2目的片段，并用T4DNA连接酶连接到pMD载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-IBDV-VP2重组质粒；所述VP2目的片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，核苷酸如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗抗原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒和变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白，其中所述变异株法氏囊病毒FJ19于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.19381。/n

【技术特征摘要】
1.一种三联灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗抗原为鸡新城疫病毒、禽流感病毒和变异株法氏囊病毒FJ19的VP2蛋白，其中所述变异株法氏囊病毒FJ19于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCCNo.19381。


2.根据权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述鸡新城疫病毒的毒株为LaSota，禽流感病毒的毒株为H9亚型的TL18株，所述TL18株于2020年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCCNO：19382。


3.根据权利要求2所述的三联灭活疫苗，其特征在于，其中LaSota病毒株的含量≥108.5EID50/0.1mL，TL18株的含量≥107.5EID50/0.1mL，变异株法氏囊病毒VP2蛋白含量的琼扩效价≥1:128。


4.根据权利要求1-3任一项所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述VP2蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：1，所述VP2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2。


5.权利要求1-4任一项所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、变异株法氏囊病毒VP2蛋白的制备；
S2、油相制备；
S3、水相制备：
S4、乳化。


6.根据权利要求5所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：
S101、pMD-IBDV-VP2重组质粒的制备：
扩增获得IBDVFJ19株的VP2蛋白，与pMD相连，获得pMD-IBDV-VP2；
S102、pFastBacI-IBDV-VP2中转质粒的制备：
将pFast...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振，钱钟，王建国，李琛，马玉峰，董昌海，杨玉倩，江媛，徐萍，李甜甜，范娟，潘杰，
申请(专利权)人：扬州优邦生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32