通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体制造技术

本发明专利技术涉及通过疏水相互作用色谱，将多特异性CrossMab抗体与其轻链错配变体在包含CrossMab双特异性抗体及其错配的抗体变体的溶液中分离的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过疏水相互作用色谱法耗尽轻链错配的抗体变体
本专利技术涉及疏水相互作用色谱将多特异性CrossMab抗体与其轻链错配变体在包含CrossMab多特异性抗体及其错配的抗体变体的溶液中分离的用途。轻链错配变体包括多特异性CrossMab抗体的一条或多条轻链与错误重链配对的抗体变体。因此，本专利技术的方法包括将多特异性CrossMab抗体与其一个或多个错配变体分离。本专利技术的疏水相互作用色谱方法可以单独使用或可以进一步与如本领域已知的标准纯化组合，以实现例如对于治疗性和/或诊断性应用的药物组合物必要的多特异性CrossMab抗体的任何纯度水平，所述药物组合物包含通过所述方法获得的所述多特异性CrossMab抗体。专利技术背景可以使用细胞融合技术、化学缀合技术或重组DNA技术生成工程化蛋白质，如能够结合两种或更多种抗原的多特异性抗体。已经开发了类型广泛的重组多特异性抗体样式，例如由如IgG抗体样式与单链结构域融合的四价双特异性抗体(参见例如Coloma,M.J.等人,NatureBiotech.15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison,S.L.,NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。长久以来已经认可双特异性抗体的治疗潜力。双特异性抗体提供能够同时结合两种抗原或两个表位的IgG样平台。因此，双特异性抗体提供了调节至少两个分子的相互作用和/或包含这些分子的至少两个系统的相互作用的潜在工具。这类调节可以例如是调节两个细胞的相互作用，其中细胞的表面上表达已识别的抗原、抗原和/或表位。双特异性抗体的治疗性用途实例例如包括调节细胞信号传导(例如，通过促进或干扰所需表面受体或配体的相互作用)和癌疗法(例如，辅助导引免疫细胞至癌细胞)。例如，WO2014/161845提供用于癌疗法的双特异性抗体，其包含对死亡受体5(DR5)特异的第一抗原结合位点和对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异的第二抗原结合位点。尽管对双特异性抗体的治疗性用途感兴趣，但证明其商业化生产棘手。早期方案致力于十分类似于天然抗体并且已经使用四合瘤(quadroma)技术产生的双特异性抗体(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540)，所述四合瘤技术基于两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体。使用四合瘤表达的抗体分子，立即显而易见，表达的分子含有两种亲本重链和两种亲本轻链的不同组合。同时表达全部四种亲本链产生了分子几乎相同的10种不同变体的混合物，其中10者中仅1者(即，表达的全部分子的仅少部分)含有为显示所需双特异性活性所必要的正确配对的重链和轻链(参见，例如，Suresh等人,MethodsEnzymol.121(1986),210-228)。因此，注意力转向基于双特异性抗体的替代性构建体，力图消除生产问题，例如，抗体可变结构域的单链融合。但是，这些样式中许多者明显异于原型抗体结构并且发现它们显示出治疗用缺点如不良药代动力学特性和/或效应子活性损失(例如，归因于不存在Fc结构域)。另外，许多构建体还显示出聚集和潜在免疫原性增长的倾向性，其原因在于存在非人类或人工的结构域如接头区域。此外，生产标准抗体依赖于相同重链/轻链亚基的二聚化。与之相反，生产双特异性抗体需要两种不同重链/轻链亚基的二聚化，每者包含不同的重链以及不同的轻链。因此，双特异性抗体生产需要多达四条肽链的恰当相互作用。因此，经常观察到链错配(例如，相同重链肽的同型二聚化或不当重链/轻链缔合)。因此，生产多特异性抗体中的一个缺点是除所需的有功能分子之外，形成多种不想要的副产物。错误配对包括错误重链彼此配对以及轻链与错误重链对应物配对或不想要的轻链配对。考虑到替代性双特异性样式的这些缺点和局限，对具有原型抗体架构的双特异性抗体仍有兴趣(尤其，IgG样架构)。在生产具有IgG样架构的所需双特异性抗体期间，主要地出现两个问题。因为这种分子需要2种不同重链和2种不同轻链恰当缔合，所以必须(1)诱导两条不同重链的异二聚化作为优选反应胜过同型二聚化，和(2)优化可能的轻链/重链组合相互作用之间的区分，从而表达的分子仅含有所需的轻链/重链相互作用。在这个方面，已经探索了基于迫使两条重链异二聚化的策略。第一种方法创造了'结入扣'(有时也称作'结在扣中'、'结-扣'或'KiH'等)，旨在通过向CH3结构域引入突变以修饰接触界面，迫使两种不同的IgG重链配对(RidgwayJB等人,ProteinEng1996；9:617-621)。例如，WO98/50431使用借助所谓‘结入扣’技术发生异二聚化的不同重链(Ridgway,J.B.,ProteinEng.9(1996)617-621；和WO96/027011)。使用这项技术，在一条链上引入具有庞大侧链的氨基酸，以产生'结'。反过来，用具有短侧链的氨基酸替换大体积氨基酸以向另一个CH3结构域中产生'扣'。通过共表达这两种重链，观察到具有异二聚化('结-扣′)重链的抗体的高产率。然而，也观察到一些同型二聚体形成(‘扣-扣′或‘结-结’)。因此，仍需要能够从异二聚体中移除同型二聚体的下游纯化程序。可以通过使用噬菌体展示方案，重塑两个CH3结构域的相互作用表面并且在两个CH3结构域之间引入二硫键以使异二聚体稳定，进一步增加异二聚化重链的百分数(MerchantA.M等人,NatureBiotech16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。新方案使用例如EP1870459A1中描述的结入扣技术原理。这种策略的一个重要限制是，两种亲本抗体的轻链不得不100％相同，以防止错误配对和无活性分子的形成。开发与全新生成的抗体匹配的共同轻链仍有挑战性。KiH法的另一个潜在问题是，突变的结构域不是全人的并且可以导致免疫原性以及还可能影响分子的结构域稳定性和聚集倾向性。由于KiH策略允许重链受迫配对，故不同的轻链可能随机地与两种重链的任一者配对并且导致产生需要彼此纯化的不同抗体。从而，这项技术不适于从两种针对第一和第二抗原的抗体开始，轻易开发针对两种抗原的重组双特异性抗体，因为不得不优化这些抗体的重链和/或相同轻链。因此，这项技术也不适宜作为基础从两种针对第一和第二抗原的抗体开始，轻易开发针对三种或四种抗原的重组三特异性或四特异性抗体，因为不得不首先优化这些抗体的重链和/或相同轻链并且随后不得不添加针对第三和第四抗原的其他抗原结合肽。一个规避双特异性抗体的错配变体问题的方案旨在强迫轻链多肽与其正确的重链对应物配对。这种方法，称作“CrossMab技术”，基于重链和轻链之间的结构域互换，因而产生特异性不同的重链和轻链的不同结构域排列。WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254和Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191涉及具有结构域互换的双价本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过使用疏水相互作用色谱(HIC)介质将多特异性CrossMab抗体与其错配变体分离的方法，所述介质包含配体置换的粒子的基质，/n(i)其中所述粒子在直径上具有50μm或更小、优选地45μm或更小、更优选地在34μm和40μm之间的平均大小并且所述配体是丁基；/n(ii)其中所述粒子在直径上具有35μm至60μm、优选地在35μm和50μm之间、更优选地在35μm和45μm之间、最优选地40μm的平均大小并且所述配体是苯基；或/n(iii)其中所述粒子在直径上具有35μm至100μm、优选地在60μm和70μm之间、最优选地65μm的平均大小并且所述配体是聚丙二醇基团。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171222 EP 17210376.41.一种通过使用疏水相互作用色谱(HIC)介质将多特异性CrossMab抗体与其错配变体分离的方法，所述介质包含配体置换的粒子的基质，
(i)其中所述粒子在直径上具有50μm或更小、优选地45μm或更小、更优选地在34μm和40μm之间的平均大小并且所述配体是丁基；
(ii)其中所述粒子在直径上具有35μm至60μm、优选地在35μm和50μm之间、更优选地在35μm和45μm之间、最优选地40μm的平均大小并且所述配体是苯基；或
(iii)其中所述粒子在直径上具有35μm至100μm、优选地在60μm和70μm之间、最优选地65μm的平均大小并且所述配体是聚丙二醇基团。


2.将多特异性CrossMab抗体与其错配变体分离的方法，包括
使包含所述CrossMab抗体及其所述错配变体的溶液经历疏水相互作用色谱(HIC)步骤，因而获得耗尽其所述错配变体的所述CrossMab抗体，
其中所述HIC步骤中使用的色谱介质包含配体置换的粒子的基质，
(i)其中所述粒子在直径上具有50μm或更小、优选地45μm或更小、更优选地在34μm和40μm之间的平均大小并且所述配体是丁基；
(ii)其中所述粒子在直径上具有35μm至60μm、优选地在35μm和50μm之间、更优选地在35μm和45μm之间、最优选地40μm的平均大小并且所述配体是苯基；或
(iii)其中所述粒子在直径上具有35μm至100μm、优选地在60μm和70μm之间、最优选地65μm的平均大小并且所述配体是聚丙二醇(PPG)基团。


3.疏水相互作用色谱(HIC)介质用于将多特异性CrossMab抗体与其错配变体分离的用途，其中HIC介质包含配体置换的粒子的基质，
(i)其中所述粒子在直径上具有50μm或更小、优选地45μm或更小、更优选地在34μm和40μm之间的平均大小并且所述配体是丁基；
(ii)其中所述粒子在直径上具有35μm至60μm、优选地在35μm和50μm之间、更优选地在35μm和45μm之间、最优选地40μm的平均大小并且所述配体是苯基；或
(iii)其中所述粒子在直径上具有35μm至100μm、优选地在60μm和70μm之间、最优选地65μm的平均大小并且所述配体是聚丙二醇(PPG)基团。


4.疏水相互作用色谱(HIC)介质将多特异性CrossMab抗体与其错配变体分离的用途，包括
使包含所述CrossMab抗体及其所述错配变体的溶液经历HIC，因而获得耗尽其所述错配变体的所述CrossMab抗体，
其中HIC介质包含配体置换的粒子的基质，
(i)其中所述粒子在直径上具有50μm或更小、优选地45μm或更小、更优选地在34μm和40μm之间的平均大小并且所述配体是丁基；
(ii)其中所述粒子在直径上具有35μm至60μm、优选地在35μm和50μm之间、更优选地在35μm和45μm之间、最优选地40μm的平均大小并且所述配体是苯基；或
(iii)其中所述粒子在直径上具有35μm至100μm、优选地在60μm和70μm之间、最优选地65μm的平均大小并且所述配体是聚丙二醇(PPG)基团。


5.根据权利要求1或2所述的分离多特异性CrossMab抗体的方法，或根据权利要求3或4的疏水相互作用色谱(HIC)介质用于将多特异性CrossMab抗体与其错配变体分离的用途，其中所述抗体的Fab区至少之一是Fab区，其中重链和轻链的可变结构域和/或恒定结构域交换，并且前提是在结合特异性不同的Fab区中产生并不相同的交换，并且前提是在具有相同结合特异性的Fab区中产生相同的交换。


6.根据权利要求1或2所述的方法，或根据权利要求3或4所述的用途，其中HIC介质选自丁基琼脂糖HP、Capto丁基ImpRes、Capto苯基ImpRes和PPG-600M。


7.根据权利要求1、2、5或6中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·冯赫施海德，P·鲁格尔，B·魏丹兹，H·赫尔腾伯格，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH