一种便携式血细胞计数试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种便携式血细胞计数试剂盒、包含其的装置及血细胞计数分析方法。所述试剂盒包括：1)固体混合物1，包含表面活性剂1和染色剂1；和/或2)固体混合物2，包含表面活性剂2和染色剂2。所述试剂盒进一步应用于血细胞计数装置和血细胞计数分析方法中。通过所述试剂盒、装置以及血细胞计数分析方法，可以实现痕量取血、便捷操作，以及满足经济环保、广泛普及的应用需求。

【技术实现步骤摘要】
一种便携式血细胞计数试剂盒
本专利技术涉及生化检测领域，具体而言，涉及检测血液样品中血细胞数目的试剂盒及其应用。
技术介绍
血细胞计数，是用于检测血细胞的特征性变量，包括血细胞的数量、形态、大小以及细胞结构、细胞周期、细胞DNA、细胞表面蛋白质和胞质所含特定蛋白质的常规检查之一，可被广泛应用于生物学和疾病学研究。通过血细胞计数分析来进行血常规检测是临床实验室常见的检测之一，通常需要使用流式细胞分析仪。这种分析仪器与技术在经济和交通不发达的偏远地区并不容易实现，因此在保证结果准确性的前提下，有必要简化样品制备步骤和仪器操作步骤。为实现这一目标，近年来研究者开发了新方法来计数红细胞、白细胞、血小板及检测其他参数。然而，这些方法都存在自身的缺点，例如：获得多个参数需要使用多个测量仪器或复杂的样品制备方法；而简单的样品制备步骤通常只能检测一个参数。最近报道的自动化血常规检测(PixCellMedical公司的HemoScreen)利用细胞在粘弹性流体中的流动结合图像分析检测了一系列血常规参数。但是这种方法需要40μL血样，不能与标准的指尖取血(所取血样体积约为10μL)相匹配。为了解决这些问题，我们已经研制出使用简单的样品制备步骤和一台商业显微镜准确地对人血中红细胞、白细胞和血小板进行计数及对白细胞进行三分类(参见文献1.LabChip2014,14,3029-3036；文献2.U.S.PatentNo.10,024,858B2；文献3.Anal.Chem.2015,87,11854)。与传统的流式细胞术计数方法相比，上述方法不涉及样品的流动，因此不需要对仪器进行校正，整个系统成本较低。我们之后拓展了这种仪器与方法的应用，用一台自制大视场显微镜检测了人体体液和动物血液，结果证明，这种方法测得的血细胞计数与金标准的临床仪器没有显著差异。(文献4.Anal.Chem.2015,87,11854.)前述的研究方法中需要制备新鲜的试剂和购买商业样品池。使用的试剂是液体状态(如：用于白细胞染色的试剂为染料的稀溶液)，不能长期保存，需要现配现用；而且，配制溶液的过程需要分步进行，以避免两种试剂间的相互干扰造成计数的误差。因此在使用受众为公众时，该方法仍不够便利。同时，使用商业样品池的成本较高将影响此研究方法的普及性；而且，商业样品池的制作材料为塑料，目前工业领域大量使用塑料使塑料回收成为环境保护领域的主要挑战之一。为了解决这些问题，专利技术计数准确、成本低廉、制备简单的环境友好型血细胞成像样品池十分重要。
技术实现思路
为了改善现有技术的不足，本专利技术的首要目的在于提供一种便携式血细胞计数试剂盒，所述试剂盒能够制备痕量血样，使用简单，利于便携，且成本低廉，经济环保，面向更广泛的应用范围。本专利技术的第二目的在于提供一种血细胞计数装置，其包含上述血细胞计数试剂盒。本专利技术的第三目的在于提供一种血细胞计数分析方法，只需要痕量取血，且样品制备步骤简单，适合广泛应用于生物学、疾病学分析。专利技术的上述目的是通过如下技术方案实现的：一方面，本专利技术提供一种试剂盒，其特征在于，包括：1)固体混合物1，包含表面活性剂1和染色剂1；和/或2)固体混合物2，包含表面活性剂2和染色剂2；所述表面活性剂1、2独立地选自用于球化和/或裂解红细胞的表面活性剂，其中表面活性剂1为固体两性表面活性剂；所述染色剂1、2独立的选自用于白细胞和血小板染色的染色剂，可以相同或不同。根据本专利技术的实施方案，所述固体混合物1可用作血细胞计数和白细胞分类，所述样品池2和混合物2可用于白细胞分类。优选的，所述固体混合物1用于血细胞计数。根据本专利技术的实施方案，所述表面活性剂1为季铵盐固体两性表面活性剂。更优选的，所述表面活性剂1为包含磺酸基和季铵盐的固体两性表面活性剂，如N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-八烷铵内盐、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵内盐、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵内盐等。根据本专利技术的实施方案，所述固体混合物1中包含的表面活性剂1和染色剂1的量分别以工作浓度为13～35μM和30～50μM为计；所述固体混合物2中包含的表面活性剂2和染色剂2的量分别以工作浓度为1～10mM和45～75μM为计。本领域技术人员可以理解，所述“工作浓度”为本领域技术人员采用试剂盒进行实验测定时，将试剂盒中的相应试剂与目标生物样本混合后用于具体测定的液体中试剂的浓度。根据本专利技术的实施方案进一步理解，所述“工作浓度”为将固体混合物1或2分别与稀释或未被稀释的血细胞样品混合后相应试剂的最终浓度。优选的，所述表面活性剂2选自阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠。优选的，所述染色剂1或2选自吖啶橙等。优选的，所述固体混合物1中包含的表面活性剂1和染色剂1的量分别以加入被稀释剂稀释的血细胞样品后工作浓度为13～35μM和30～50μM为计，更优选的以18～30μM和35～45μM为计，最优选的以22μM和37.5μM为计；优选的，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为40～80倍，更优选的，所述倍数为50～70倍，最优选的为60～62倍。优选的，所述固体混合物2中包含的表面活性剂2和染色剂2的量分别以加入未被稀释的血细胞样品后工作浓度为1～10mM和45～75μM为计，更优选的以2～8μM和50～65μM为计，最优选的，为5.2mM和52.5μM为计。根据本专利技术的实施方案，所述固体混合物1和固体混合物2同时存在时，优选分别置于试剂盒内的两个不同容器中，例如将固体混合物1置于容器1中，将固体混合物2置于容器2中。根据本专利技术的实施方案，所述试剂盒还可以包括一个或多个样品池，优选的，所述试剂盒包括两个样品池。所述一个样品池厚度优选为60～150μm，更优选为100μm；另一个样品池厚度优选为10～50μm，更优选为20μm。根据本专利技术，所述试剂盒还包含稀释剂；所述稀释剂优选为磷酸盐缓冲溶液，所述稀释剂优选置于与固体混合物1、固体混合物2不同的容器中，例如置于容器3中。根据本专利技术，所述试剂盒还可以包括一个或多个微量进样器；优选的，所述微量进样器可为三个，采用不同体积规格，如体积分别为1μL、5μL、50μL。优选的，所述试剂盒包括：两个样品池；固体混合物1、2分别置于容器1、容器2中；稀释剂置于容器3；以及3个不同体积的微量进样器。另一方面，本专利技术还提供一种制备所述试剂盒中的所述样品池的方法，包括：使用玻片、玻璃胶、头发丝等材料，用软压印(Softlithography)的方法来制作。当制作细胞计数样品池时，利用头发丝控制样品池厚度和保证边缘处红细胞不聚集，移取制备好的血样，使其在毛细作用和亲水力的作用下流进细胞计数样品池。白细胞分类样品池的制作不需要使用头发丝固定，其余制作步骤与细胞计数样品池类似。所述方法包括：(1)制作印章：使用模具制成印章，例如制成PDMS(聚二甲基硅氧烷)印章；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其特征在于，包括：/n1)固体混合物1，包含表面活性剂1和染色剂1；/n和/或/n2)固体混合物2，包含表面活性剂2和染色剂2；/n所述表面活性剂1、2独立地选自用于球化红细胞的表面活性剂，其中表面活性剂1为固体两性表面活性剂；所述染色剂1、2独立的选自用于白细胞和血小板染色的染色剂，可以相同或不同；所述固体混合物1可用作血细胞计数和白细胞分类，所述样品池2和混合物2可用于白细胞分类；优选的，所述固体混合物1用于血细胞计数。/n

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，包括：
1)固体混合物1，包含表面活性剂1和染色剂1；
和/或
2)固体混合物2，包含表面活性剂2和染色剂2；
所述表面活性剂1、2独立地选自用于球化红细胞的表面活性剂，其中表面活性剂1为固体两性表面活性剂；所述染色剂1、2独立的选自用于白细胞和血小板染色的染色剂，可以相同或不同；所述固体混合物1可用作血细胞计数和白细胞分类，所述样品池2和混合物2可用于白细胞分类；优选的，所述固体混合物1用于血细胞计数。


2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂1为季铵盐固体两性表面活性剂；更优选的，所述表面活性剂1为包含磺酸基和季铵盐的固体两性表面活性剂，如N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵内盐、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵内盐、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵内盐等；所述表面活性剂2选自阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠；所述染色剂1或2选自吖啶橙等；所述固体混合物1中包含的表面活性剂1和染色剂1的量分别以工作浓度为13～35μM和30～50μM为计；所述固体混合物2中包含的表面活性剂2和染色剂2的量分别以工作浓度为1～10mM和45～75μM为计。


3.根据权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述固体混合物1中包含的表面活性剂1和染色剂1的量分别以加入被稀释剂稀释的血细胞样品后工作浓度为13～35μM和30～50μM为计，更优选的以18～30μM和35～45μM为计，最优选的以22μM和37.5μM为计；优选的，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为40～80倍，更优选的，所述倍数为50～70倍，最优选的为60～62倍。
所述固体混合物2中包含的表面活性剂2和染色剂2的量分别以加入未被稀释的血细胞样品后工作浓度为1～10mM和45～75μM为计，更优选的以2～8μM和50～65μM为计，最优选的，为5.2mM和52.5μM为计。


4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述固体混合物1和固体混合物2同时存在时，优选分别置于试剂盒内的两个不同容器中，例如将固体混合物1置于容器1中，将固体混合物2置于容器2中；
所述试剂盒还包含稀释剂；所述稀释剂优选为磷酸盐缓冲溶液，所述稀释剂优选置于与固体混合物1、固体混合物2不同的容器中，例如置于容器3中；
所述试剂盒还可以包括一个或多个微量进样器；优选的，所述微量进样器可为三个，采用不同体积规格，如体积分别为1μL、5μL、50μL；
优选的，所述试剂盒包括：两个样品池；固体混合物1、2分别置于容器1、容器2中；稀释剂置于容器3；以及3个不同体积的微量进样器。


5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还可以包括一个或多个样品池，优选的，所述试剂盒包括两个样品池；所述一个样品池厚度优选为60～150μm，另一个样品池厚度优选为10～50μm。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品池的制备包括如下步骤：
(1)制作PDMS印章：用PDMS与固化剂(例如按照8：1～11:1的质量比)倾倒在固定有模具的培养皿上...

【专利技术属性】
技术研发人员：高婷娟，李欣怡，邓琼，唐浴尘，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42