一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物及应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物及应用。在一管PCR反应液中利用特殊的引物设计可同时扩增Y染色体AZF区域序列标记位点与性染色体数目检测位点，同时以男性性别决定基因（SRY）作为性别异常对照、人类X/Y连锁锌指蛋白基因（ZFX/Y）作为内对照，通过毛细管电泳分析PCR产物，对照不同片段大小的PCR产物判读Y染色体AZF区域是否缺失、性染色体数目是否异常。从DNA样本开始，3小时内可以出结果，只需要一次PCR实验即可同时检测Y染色体微缺失与克氏综合征，检测技术流程简单，容易实现标准化。

【技术实现步骤摘要】
一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物及应用
本专利技术涉及分子生物学诊断领域，涉及一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物及应用。
技术介绍
据WHO数据统计，全世界有10~15%的夫妇患有不孕不育症，其中男性因素占50%，而遗传因素又占男性不育的30%，在精子发生障碍引起的男性不育患者中，克氏综合征是发生率最高的遗传因素，Y染色体微缺失居于第二位。克氏综合征(Klinefeltersyndrome，KS)为最常见的性染色体异常疾病，又称为先天性睪丸发育不全症候群，为减数分裂时性染色体不分离，导致男性有两条或以上的X染色体，约90%的患者核型为47XXY，10%为47,XXY/46,XY嵌合型、48XXXY、48XXYY、49XXXXY与结构型性染色体异常，患者临床表型多样，主要有生殖功能低下，外貌异常（身材高大、骨骼细长、乳房发育及臀部宽大等女性化特征），认知心理障碍（智力低下、抑郁、焦虑、精分、自闭症、孤独症等）及代谢综合征（高血糖、高血脂）等。克氏综合征是男性原发性性腺功能减退(primaryhypogonadism)最常见的病因。由于患者细胞内多了一个额外的X染色体，因此影响了睪丸的正常发育，睾丸曲细精管纤维化样变，管腔闭塞，无精子发生。仅次于克氏综合征，Y染色体微缺失是遗传性男性不孕的第二主因，Y染色长臂上具有三个无精子因子(AzoopermiaFactor，AZF)区域，为AZFa、AZFb、AZFc，此三个区域会发生独立或联合缺失，AZF区域的缺失造成精子发生障碍。AZFa区域缺失表现为唯支持细胞综合征（SCO综合征），无精子生成；AZFb区域缺失表现为精母细胞阶段生精过程阻滞，无精子生成，临床表征相似于AZFa，无法借由人工技术获取精子；AZFc缺失的临床表征多样，会出现少精子症与无精子症等，在临床上最为常见，约占Y染色体微缺失的80%，AZFc缺失患者具有部分精子发生的能力，因此部分案例会表现为少精子症，AZFc患者有50%可藉由睪丸取精术(TESE)与卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)来获得子代。Y染色体的微缺失诊断根据EAA/EMQNbestpracticeguidelinesformoleculardiagnosisofY-chromosomalmicrodeletions:state-of-the-art2013,通过PCR扩增选定区域判读区域是否缺失，目前的检测方法有多重酶链式反应扩增法搭配琼脂糖胶体电泳、荧光实时定量聚合酶链式反应扩增法、多重连接探针扩增技术法、荧光原位杂交法等。克氏综合征常规的诊断方法，除了Y染色体微缺失所提到的多重连接探针扩增技术法与基因芯片法外，最常使用并做为金标准的方法为DNA染色体核型分析。多重酶链式反应扩增(MultiplexPolymeraseChainReaction)搭配琼脂糖胶体电泳，利用多重PCR技术扩增在三个不同AZF区域上的专一性位点，为目前应用最广泛的方法，多重PCR技术扩增后的产物利用琼脂糖胶体电泳技术区分，利用已知的产物长度进行辨识，该方法操作简单、成本低廉，但琼脂糖胶体电泳存在接触有毒染剂的风险，且胶体电泳分辨率低的缺陷，无法实现单管反应，检测上耗时耗工。荧光实时定量聚合酶链式反应扩增法(QuantificationPolymeraseChainReaction,qPCR)在探针加上荧光修饰，在聚合酶链式反应扩增过程中侦测荧光强度，设定检测阈值对不同位点的扩增产物定量，不需电泳检测，减少操作步骤与时间，由于荧光的变化非常灵敏，因此比传统PCR方法更加灵敏，但受限于探针荧光修饰的数量限制，每管反应能检测的位点较少，因此需要分为多管操作Y染色体微缺失检测，限制了荧光实时定量聚合酶链式反应扩增法在Y染色体微缺失检测的应用。多重连接探针扩增技术法(MultiplexLigation-dependentProbeAmplification,MLPA)搭配毛细管电泳仪分析为近年发展的一种待检DNA序列定性和半定量分析的新技术。MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。MLPA结合DNA探针杂交与PCR技术，能单次反应中检测40个或以上位点、能检测点突变；但对待测DNA的浓度要求较高、样本容易受污染、试剂的成本较高、对于操作人员的要求较高，整个实验的流程需要约两天，相对其他检测法更为耗时。荧光原位杂交法(Fluorescenceinsituhybridization)是将荧光素直接或间接标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交，经洗涤后直接在荧光显微镜下观察，与传统的放射性标记原位杂交相比有操作快速、检测讯号强、特异性高与可重复染色等优点，但相比于多重PCR、实时定量荧光PCR、芯片法等相比，检测的步骤繁琐、周期较长，灵敏度与特异性较低，受限于显微镜分辨率，对操作人员判读的要求较高。克氏综合征常规的诊断方法，包括常规血清学检查、精液检查，其确诊需要进行染色体核型分析，染色体核型分析是透过将染色体经蛋白酶处理后染色，染色后依照染色体长度、着丝点位置等特征排序、编号染色体，透过染色体的结构或数目来诊断染色体是否异常，染色体核型分析对样本的需求量较大，需要体外培养羊水细胞，细胞生长速度不一，做染色体的染色与排序耗时费力，平均需一至两周的时间得到结果，对羊水抽取技术与染色体辨识有一定的要求，在时间与人力的成本相当高。本专利技术可用于体外定性检测男性抗凝全血DNA样本中Y染色体微缺失及克氏综合征性染色体倍型(XXY)所致男性无精症、少精症者的辅助诊断，其检测结果可以用于辅助确定无精、少精患者病因，避免不必要的药物及手术治疗，避免将有缺陷基因传递给下一代，减少病人痛苦，提高辅助生殖成功几率，对于克氏综合征患者的准确用药可以促进患者的男性化，改善其精神状态，增强性功能，从而提高患者的生活质量等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物及应用，在一管内实现Y染色体AZF区域与性染色体多态位点设计特异性引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物，其特征在于：所述引物包含以下：/n（1）Y染色体长臂AZF区域的专一性引物，至少针对三个以上序列标记位点进行扩增，标记位点包含sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY82、sY83、sY1064、sY1065、sY1182、sY88、sY105、sY121、sY1224、sY143或sY1192、sY153或Y160，以上所述各位点上游引物5’端与下游引物5’端包含相同非人源性基因组序列；/n（2）性染色体专一性引物，至少针对两个以上性染色体检测位点进行扩增，检测位点包含Amelogenins、TAF9、ZFX/Y、SRY或一个以上X染色体或Y染色体短串联重复序列，以上所述各位点上游引物5’端与下游引物5’端包含相同非人源性基因组序列；/n（3）包含与各检测位点引物5’端相同或部分相同的非人源性基因组引物SEQ ID NO.1，其中所述非人源性基因组引物包含至少一种以上的非人源基因组序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物，其特征在于：所述引物包含以下：
（1）Y染色体长臂AZF区域的专一性引物，至少针对三个以上序列标记位点进行扩增，标记位点包含sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY82、sY83、sY1064、sY1065、sY1182、sY88、sY105、sY121、sY1224、sY143或sY1192、sY153或Y160，以上所述各位点上游引物5’端与下游引物5’端包含相同非人源性基因组序列；
（2）性染色体专一性引物，至少针对两个以上性染色体检测位点进行扩增，检测位点包含Amelogenins、TAF9、ZFX/Y、SRY或一个以上X染色体或Y染色体短串联重复序列，以上所述各位点上游引物5’端与下游引物5’端包含相同非人源性基因组序列；
（3）包含与各检测位点引物5’端相同或部分相同的非人源性基因组引物SEQIDNO.1，其中所述非人源性基因组引物包含至少一种以上的非人源基因组序列。


2.一种检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物，其特征在于：所述引物包含以下：
（1）Y染色体长臂AZF区域的专一性引物，至少针对三个以上序列标记位点进行扩增，标记位点包含sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255、sY82、sY83、sY1064、sY1065、sY1182、sY88、sY105、sY121、sY1224、sY143或sY1192、sY153或Y160，以上所述各位点上游引物5’端与下游引物5’端包含不同非人源性基因组序列；
（2）性染色体专一性引物，至少针对两个以上性染色体检测位点进行扩增，检测位点包含Amelogenins、TAF9、ZFX/Y、SRY或一个以上X染色体或Y染色体短串联重复序列，以上所述各位点上游引物5’端与下游引物5’端包含不同非人源性基因组序列；
（3）包含与各检测位点上游引物5’端相同或部分相同的非人源性基因组引物SEQIDNO.1、下游引物5’端相同或部分相同的非人源性基因组引物SEQIDNO.2，其中所述非人源性基因组引物包含至少两种以上的非人源基因组序列。


3.根据权利要求1或2所述的检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物，其特征在于，至少一种非人源性基因组引物包含荧光修饰。


4.根据权利要求1或2所述的检测Y染色体微缺失和性染色体数目的引物组合物，其特征在于，所述引物具体包含以下：
第一引物P1

TCGACGCACGCTCCTGCTACAGGGTCGGTGCACCTAAATAA，
第二引物P2：

TCGACGCACGCTCCTGCTACATGCACTAAAGAGTGATAATAAATTCTG，
第三引物P3：

TCGACGCACGCTCCTGCTACATTGTAATCCAAATACATGGGC，
第四引物P4：

TCGACGCACGCTCCTGCTACACACCCAGCCATTTGTTTTAC，
第五引物P5：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAGCATCCTCATTTTATGTCCAAC，
第六引物P6：

TCGACGCACGCTCCTGCTACACAACCCAAAAGCACTGAGTA，
第七引物P7：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAGTCTGCCTCACCATAAAACG，
第八引物P8：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAACCACTGCCAAAACTTTCAA
第九引物P9：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAGTGACACACAGACTATGCTTC，
第十引物P10：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAACACACAGAGGGACAACCCT，
第十一引物P11：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAGGGTGTTACCAGAAGGCAAA，
第十二引物P12：

TCGACGCACGCTCCTGCTACAGAACCGTATCTACCAAAGCAGC，
第十三引物P13：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCGTTACAGGATTCGGCGTGAT，
第十四引物P14：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCTCGTCATGTGCAGCCAC，
第十五引物P15：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCAGTTCACAGAATGGAGCCTG，
第十六引物P16：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCCCTGTGACTCCAGTTTGGTC，
第十七引物P17：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCTACGGGTCTCGAATGGAATA，
第十八引物P18：
TGACCGTCTGCGCCTCGTTCTCATTGCATTCCTTTCCATT，
第十九引物P19：
TGACC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陳昱瑋，郭亦亦，邱一帆，钟丽霞，李淑如，
申请(专利权)人：胜亚生物科技厦门有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35