用于微卫星不稳定性检测的生物标志物组合、试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物标志物组合，并公开一种基于下一代测序技术进行微卫星不稳定性检测的引物组合物、方法和试剂盒。本发明专利技术的引物组合物包括上游引物组和下游引物组，对应于30个微卫星不稳定性位点。本发明专利技术的方法在很大程度上简化了检测操作过程并降低检测成本，具有通量高、灵敏度高、特异性高的特点。

【技术实现步骤摘要】
用于微卫星不稳定性检测的生物标志物组合、试剂盒及其用途
本专利技术涉及生物标志物组合，一种基于下一代测序技术进行微卫星不稳定性检测的引物组合物、方法和试剂盒。
技术介绍
微卫星是广泛分布于人类基因组中单个或多个串联重复核苷酸序列。由1-6个核苷酸组成，具有高度多态性，大多数串联重复核苷酸序列通常为15-60个重复，通常位于基因间隔区、启动子、UTR和编码区。正常人体细胞复制过程中，在错配修复系统的帮助下，微卫星的分子结构保持稳定不变，避免遗传物质发生改变，保证DNA复制的高保真度。但在某些因素作用下，如HNPCC(林奇综合征)或者癌症中微卫星的DNA在复制过程中由于滑动等因素，导致双链分子的碱基发生错配、插入或缺失，引起微卫星的结构发生改变，这种结构上发生改变的微卫星就叫做微卫星不稳定性(MicrosatelliteInstability,MSI)。微卫星不稳定状态被分为三种：高不度微卫星不稳定(MSI-H)和低度微卫星不稳定(MSI-L)和微卫星稳定(Microsatellitestability，MSS)。NCCN发布的结肠癌和直肠癌临床实践指南推荐所有具有结直肠癌与直肠癌患病史的病人进行MSI检测，以指导临床用药和免疫治疗、诊断林氏综合征(Lynchsyndrome)，因此MSI检测已成为临床常规检测。目前常用的MSI检测技术主要有以下两大类：1.DNA错配修复缺陷检测：对导致MSI发生的相关基因，主要是DNA错配修复系统(MMR)基因进行基因突变检测，或对其表达的蛋白水平运用免疫组化的方法进行检测。2.PCR检测(MSI-PCR):通过选定特异的引物，以自身正常组织为对照，在体外对微卫星位点进行PCR或者多重荧光PCR扩增，扩增产物经过凝胶电泳显像或Sanger片段大小分析其产物片段有无迁移率的改变，从而判定MSI的状态。目前常用的两类技术中，对于DNA错配修复基因缺陷的检测，传统的基因测序方法，如Sanger测序等，具有高成本，低通量，低精度，对实验条件要求高等问题，在临床应用尚未普及，对于免疫组化方法，存在对样本质量要求高，操作复杂，通量低，结果的界定过度依赖读片人的主观看法等缺点。PCR法已成为目前常用检测方法并已被证明是最有效的初筛手段。但普通PCR分管检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷。然而普通的PCR方法存在操作程序繁琐、耗时长、灵敏度低、检测结果不确定性高等问题；而多重PCR检测中，不同引物之间的干扰关系十分复杂，扩增产物混杂度较高，对引物的选择及浓度要求较高，单次检测时可检测的微卫星位点数量有限，且MSI-H和MSS区分度不高。为解决上述微卫星位点数量有限、灵敏度低、检测结果不确定性高等问题，本专利技术使用多重PCR法富集30个区分度较强的微卫星位点，并使用下一代测序技术进行测序，结合生物信息学分析手段，同时评估多个微卫星位点的突变状态。本专利技术不仅操作简单、耗时短、通量高，检测的灵敏度和精确度也得到了提升，解决了目前常用检测方法的问题。
技术实现思路
本专利技术涉及一种生物标志物组合，以及基于下一代测序技术进行微卫星不稳定性检测的引物组合物、方法和试剂盒。一种生物标志物组合，包括如下所述的30个微卫星位点的组合，所述微卫星位点为：Loci_19、Loci_483、Loci_162、Loci_62、Loci_127、Loci_420、Loci_328、Loci_231、Loci_262、Loci_46、Loci_481、Loci_376、Loci_9、Loci_316、Loci_387、Loci_245、Loci_213、Loci_402、Loci_270、Loci_140、Loci_339、Loci_348、Loci_260、Loci_203、Loci_83、Loci_94、Loci_486、Loci_430、NR24、NR27。一种引物组合物，其包括上游引物组和下游引物组，其中所述上游引物组中的各引物分别特异性结合至上述的各微卫星位点的上游，所述下游引物组中的各引物分别特异性结合至上述的各微卫星位点的下游。优选的，所述上游引物组的各引物和/或所述下游引物组的各引物为rhPCR引物(RNaseH-DependentPCR，见美国专利申请号US12433896，公开号US20090325169A1)。优选地，所述引物组合物，其上游引物组选自由序列为SEQIDNo：1-30的引物组成的组；所述下游引物组选自由序列为SEQIDNo：31-60的引物组成的组。一种基于二代测序平台检测微卫星状态的试剂盒，所述试剂盒包括前述的引物组合物。进一步的，微卫星状态的检测使用二代测序(NextGenerationSequencing,NGS)技术。进一步的，所述微卫星状态包括高度微卫星不稳定(MSI-H)和微卫星稳定(MSS)型。一种引物组合物在制备检测微卫星状态的试剂盒中的应用，所述引物组合物包括上游引物组和下游引物组，所述上游引物组的各引物和/或所述下游引物组的各引物为rhPCR引物。进一步的，所述上游引物组由序列为SEQIDNo：1-30的引物组成；所述下游引物组由序列为SEQIDNo：31-60的引物组成。一种生物标志物在制备用于检测微卫星状态的试剂盒中的应用，所述生物标志物包括上述的30个微卫星位点。进一步的，所述微卫星状态包括高度微卫星不稳定(MSI-H)和微卫星稳定(MSS)型。本专利技术使用rhPCR引物和扩增方法，避免了不同引物之间的干扰，单次检测时可同时检测更多的微卫星位点，提高MSI-H和MSS的区分度，操作简单耗时短，通量高。本专利技术使用扩增法对微卫星位点进行富集，相对于捕获法，扩增法对微卫星长度没有明显的偏好，在微卫星位点的长度增大时，依然保持有效的信号富集，更加有利于MSI-H和MSS的区分，灵敏度高。本专利技术的30个微卫星位点的组合，用于检测微卫星状态，准确度及灵敏度高，对于MSI-H和MSS的区分度高，检测稳定性好。附图说明图1.捕获法与本专利技术的微卫星位点长度-深度相关图图2.PCR金标准验证验证本专利技术的可靠性结果图3.本专利技术检测灵敏度具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生物标志物组合，其包括如下所述的30个微卫星位点的组合，所述微卫星位点为Loci_19、Loci_483、Loci_162、Loci_62、Loci_127、Loci_420、Loci_328、Loci_231、Loci_262、Loci_46、Loci_481、Loci_376、Loci_9、Loci_316、Loci_387、Loci_245、Loci_213、Loci_402、Loci_270、Loci_140、Loci_339、Loci_348、Loci_260、Loci_203、Loci_83、Loci_94、Loci_486、Loci_430、NR24、NR27。/n

【技术特征摘要】
1.生物标志物组合，其包括如下所述的30个微卫星位点的组合，所述微卫星位点为Loci_19、Loci_483、Loci_162、Loci_62、Loci_127、Loci_420、Loci_328、Loci_231、Loci_262、Loci_46、Loci_481、Loci_376、Loci_9、Loci_316、Loci_387、Loci_245、Loci_213、Loci_402、Loci_270、Loci_140、Loci_339、Loci_348、Loci_260、Loci_203、Loci_83、Loci_94、Loci_486、Loci_430、NR24、NR27。


2.一种引物组合物，其包括上游引物组和下游引物组，其中所述上游引物组中的各引物分别特异性结合至权利要求1所述的微卫星位点的上游，所述下游引物组中的各引物分别特异性结合至权利要求1所述的微卫星位点的下游。


3.如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，所述上游引物组的各引物和/或所述下游引物组的各引物为rhPCR引物。


4.如权利要求3所述的引物组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李夏静，王磊，许青，陈才夫，熊磊，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31