一种基于核酸分子机器比色法的耐药菌检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸分子机器的比色法的耐药菌检测方法，包括如下步骤：(1)构建细菌特异性响应的双探针：将巯基修饰的双探针链1和双探针链2与纳米材料混合，调节pH，然后静置、离心，得到细菌特异性响应的双探针Probe1和Probe2；(2)制备反应液：将细菌特异性响应的双探针与反应混合物储存于离心管中，制备得到反应液；其中，所述反应混合物包括双链核酸(RNA1‑RNA2‑Aptamer)以及EXOIII；(3)检测细菌：将待测菌液与步骤(2)制备得到的反应液按照一定的体积比混合，进行孵化反应，并测定紫外吸收度，确定细菌种类。本发明专利技术方法以两倍的酶切速率进行信号循环放大，可以更快速鉴别医院中常见的耐药菌，整个检测过程小于4小时，灵敏度、准确度；具有良好的特异性，操作简单以及肉眼可见的优势，同时为细菌快速诊断试剂盒的研发奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸分子机器比色法的耐药菌检测方法
本专利技术涉及检测
，具体涉及一种基于核酸分子机器的比色法的耐药菌检测方法。
技术介绍
抗生素耐药性是一个迫在眉睫的威胁全球健康的问题，自英国细菌学家亚历山大·弗莱明(AlexanderFleming)1928年发现青霉素，1940年青霉素G被首选应用于临床以来，抗生素的应用至今已77年了，抗生素对人类健康和医学进步做出了巨大贡献，但是，耐药菌的出现有可能使人类重新回到对多种感染无药可用的“前抗生素”黑暗时代。基于6种病原菌药物耐药性上升的情况，到2050年估计除非采取行动，否则AMR导致死亡的人数每年可以增加到1000万人，到2050年对全球经济产生的累计成本达100万亿美元。在此基础上，到2050年，死亡人数会惊人的达到每三秒钟就会有一个人死亡，人均治疗费用会达到一万美元。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是一种耐多重抗生素的“超级细菌”(一类耐β-内酰胺类抗生素(如青霉素、甲氧西林、双氯西林、萘夫西林、苯睉青霉素和头孢菌素等)的金黄色葡萄球菌)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起范围疾病，从皮肤到伤口感染以及肺炎和血液感染严重时会导致败血症和死亡。金黄色葡萄球菌细菌，包括MRSA，是最常见的原因之一导致卫生保健相关感染病。传统的耐药细菌检测方法包括细菌培养法、PCR(聚合酶链式反应)和基因测序等。细菌培养方法是临床细菌检测的吸收度方法，但是检测过程繁琐，耗时较长，培养法耗时长达24～72小时(对于难培养或生长缓慢的细菌则无能为力)，同时无法揭示耐药机制，不适用于细菌的快速检测。PCR(聚酶链式反应)和基因组测序灵敏度高、特异性好，可达到痕量级检测，针对低含量细菌检测具有重大意义技术依赖于已知的耐药基因参照序列，故无法分析未知的耐药性，且通常无法定量检测，因此一般情况下只能作为一种辅助手段。这些常规的细菌检测方法在灵敏度、特异性、检测速度、耗费、以及细菌高通量检测分析方面都有一定的局限性，因此亟需建立一种简单、快速、灵敏、可视化的细菌检测方法具有重要意义。
技术实现思路
针对上述的不足之处，本专利技术提供了一种基于核酸分子机器的比色法的耐药菌检测方法，即一种简单、快速、可视化的耐药细菌检测方法。本专利技术提出的基于核酸分子机器的比色法的耐药菌检测方法，将待测菌液和双探针(Probe1和Probe2)按照一定的体积比混合，置于37℃恒温箱孵育，此时反应溶液中的双探针在双核酸分子机器(其中，所述双核酸分子机器具体指代RNA1+Probe1和RNA2+Probe2，RNA在探针Probe表面运动，EXOIII的作用是驱动RNA在探针Probe表面运动，因此RNA+Probe组成一套分子机器)的酶切信号循环放大作用下逐步将双探针表面的碱基剪切下来，双探针中的金球由于失去了ssDNA的保护作用而发生团聚，使得溶液的颜色由红变灰，通过测定待测溶液紫外吸收度的变化，可以快速鉴别不同种类的细菌。本专利技术采用pH调控法制备双探针，时间短，结合效率高，显著高于传统的盐老化法。另外，采用本专利技术所提供的方法，整个检测时间可控制在4小时内，灵敏度、准确度、检测时间等均显著优于传统检测方法，传统的病原菌检测的标准方法为先进行细菌的培养(至少24个小时)，再进行耐药性测试，以确定该种细菌对哪种抗生素产生抗药性，往往费时费力且假阳性信号大。在一具体实施方案中，分别将巯基修饰的双探针链1和双探针链2修饰在13nm的金球上，制备成耐药细菌特异性响应的双探针(Probe1和Probe2)，其中双探针Probe1和Probe2均为ssDNA。将双探针和反应液按照一定的摩尔比例加入到待测菌液中，然后恒温孵化，此时Aptamer从双链核酸(RNA1-RNA2-Aptamer)中解离下来(因为Aptamer与细菌具有更强的亲和力所以会从双链核酸上解离下来)，结合在细菌表面，RNA1和RNA2会结合到与之互补的Probe1和Probe2上，在双核酸分子机器(RNA1+Probe1和RNA2+Probe2)的作用下，RNA1和RNA2会在双探针上发生酶切反应，把双探针上的核苷酸剪切下来，金纳米粒子失去ssDNA的保护作用后会发生团聚，产生颜色变化，从而实现细菌特异性、可视化的检测。本专利技术基于核酸分子机器比色法的耐药菌检测方法，包括以下步骤：(1)构建细菌特异性响应的双探针将巯基修饰的双探针链1与双探针链2与纳米材料混合，调节pH，然后静置、离心，得到细菌特异性响应的双探针Probe1和Probe2，然后测定双探针的浓度，用于构建(得到)细菌特异性响应的双探针Probe1和Probe2。(2)制备反应液将细菌特异性响应的双探针与反应混合物储存于离心管中，制备得到反应液；其中，所述反应混合物包括双链核酸(RNA1-RNA2-Aptamer)以及EXOIII。(3)检测细菌将待测菌液与步骤(2)制备得到的反应液按照一定的体积比混合，进行孵化反应，并测定紫外吸收度，确定细菌种类。步骤(1)中，所述双探针Probe1和Probe2的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示：探针1/Probe1：探针2/Probe2：本专利技术步骤(1)中的双探针，其序列并非限于上述SEQIDNO.1、SEQIDNO.2，还可采用其他序列。步骤(1)中，所述纳米材料选自金球(AuNPs)、碳纳米管、石墨烯二维材料等中的一种或多种；优选地，为金球(AuNPs)。其中，所述纳米材料的粒径为10-18nm；优选地，为13nm。其中，所述纳米材料具有良好的光学特性、较高的电子密度、良好的生物相容性以及催化性能、表面等离子体共振和聚集态的敏感性等。当所述纳米材料为金球(AuNPs)时AuNPs(d＞3.5nm)之间距离的减小会导致颗粒间表面等离子体偶联，在纳米级浓度下，可见颜色由红色变为灰色。步骤(1)中，所述双探针链1、双探针链2、纳米材料的摩尔比为(100-150)∶(100-150)∶1；优选地，为120∶120∶1。步骤(1)中，所述混合的温度为22℃-27℃；优选地，为25℃。步骤(1)中，所述pH＝2.5-3.5；优选地，为pH＝3。步骤(1)中，所述静置优选为避光静置。其中，所述静置的时间为12-18min；优选地，为15min。步骤(1)中，所述离心的速率为9000-12000r；优选地，为10000r。步骤(1)中，所述离心的时间为13-18min；优选地，为15min。本专利技术中，双探针链1即双探针Probe1；双探针链2即双探针Probe2。步骤(1)中，测定双探针的浓度的目的在于：由于双探针是ssDNA与纳米材料制备而成，双探针的浓度不同，纳米材料(如金球)的颜色也不同，本专利技术需要确定双探针的浓度以便选择一种合适的浓度进行后续的比色实验。步骤(2)中，所述反应混合物中的双链核酸(RNA1-RNA2-Aptamer)和EXOI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于核酸分子机器比色法的耐药菌检测方法，其特征在于，将待测菌液和双探针混合，经恒温孵育，在RNA walker的酶切信号循环放大作用下逐步将双探针表面的碱基剪切，双探针中的金球由于失去了ssDNA的保护作用而发生团聚，反应溶液的颜色由红变灰，通过测定待测反应溶液紫外吸收度的变化而实现对待测菌液的耐药菌检测；/n所述方法包括如下步骤：/n(1)构建细菌特异性响应的双探针/n将巯基修饰的双探针链1和双探针链2与纳米材料混合，调节pH＝3，然后静置、离心，得到细菌特异性响应的双探针；/n(2)制备反应液/n将细菌特异性响应的双探针与反应混合物混合，制备得到反应液；其中，所述反应混合物包括双链核酸RNA1-RNA2-Aptamer以及EXOIII；/n(3)检测细菌/n将待测菌液与步骤(2)制备的反应液按照一定的体积比混合，进行孵化反应，并测定紫外吸收度，确定细菌种类和数量。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸分子机器比色法的耐药菌检测方法，其特征在于，将待测菌液和双探针混合，经恒温孵育，在RNAwalker的酶切信号循环放大作用下逐步将双探针表面的碱基剪切，双探针中的金球由于失去了ssDNA的保护作用而发生团聚，反应溶液的颜色由红变灰，通过测定待测反应溶液紫外吸收度的变化而实现对待测菌液的耐药菌检测；
所述方法包括如下步骤：
(1)构建细菌特异性响应的双探针
将巯基修饰的双探针链1和双探针链2与纳米材料混合，调节pH＝3，然后静置、离心，得到细菌特异性响应的双探针；
(2)制备反应液
将细菌特异性响应的双探针与反应混合物混合，制备得到反应液；其中，所述反应混合物包括双链核酸RNA1-RNA2-Aptamer以及EXOIII；
(3)检测细菌
将待测菌液与步骤(2)制备的反应液按照一定的体积比混合，进行孵化反应，并测定紫外吸收度，确定细菌种类和数量。


2.如权利要求1所述的耐药菌检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述双探针链1和双探针链2的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示：
双探针链1：HS-TTTTTAAAGAAAGGGATTGCT(SEQIDNO.1)；
双探针链2：HS-TTTTTACCCCGACTCGGTTAA(SEQIDNO.2)。


3.如权利要求1所述的耐药菌检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述待测菌液含有的细菌为MRSA。


4.如权利要求1所述的耐药菌检测方法，其特征在于，所述恒温孵育的温度为35-38℃。


5.如权利要求1所述的耐药菌检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pH用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐中的一种或多种进行调节；和/或，所述pH＝3-4；和/或，所述纳米材料选自金球AuNPs、碳纳米管、石墨烯二维材料中的一种或多种；和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴昊，邹奎，李丽，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31