利用非抗生素筛选的游离型质粒载体制备iPSC的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种利用非抗生素筛选的游离性质粒载体制备iPSC的方法。所述诱导多能干细胞的制备方法包括：通过非抗生素筛选的游离型质粒载体重编程血液细胞，即得到诱导多能干细胞。本发明专利技术公开的制备方法通过使用非抗生素筛选的游离性质粒载体避免了抗生素筛选而采用蔗糖筛选，得到的多能干细胞安全性更高，适用于生产临床级iPSC。并且非抗生素筛选的游离型重编程质粒的细菌序列大小缩减到500bp以下，因此提高了蛋白表达的水平和持续时间，大大提高了重编程的效率。

【技术实现步骤摘要】
利用非抗生素筛选的游离型质粒载体制备iPSC的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用非抗生素筛选的游离性质粒载体制备iPSC的方法。
技术介绍
2006年，Takahashi和Yamanaka利用逆转录病毒载体将四种转录因子OSKM即八聚体集合转录因子4(octamer-bindingtranscriptionfactor4，Oct4)、性别决定区Y框蛋白2(sexdeterminingregionYboxprotein2，Sox2)、Kuppel样因子4(kruppel-likefactor4，Klf4)和C-髓细胞组织增生原癌基因(cellularmyelocytomatosisoncogene，c-Myc)转入小鼠成纤维细胞，获得了诱导多能干细胞(inducedPluripotentStemCell，iPSC)。鉴于iPSC在生物学特性上与胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)极其相似，而且有效避免了伦理限制和取材困难等问题，因此其在疾病模型、药物筛选、发育生物学研究和细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。Yamanaka也因这一开创性的成果而获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖(TakahashiK1andYamanakaS.2006)。2007年11月，Yamanaka研究组使用了同样的方法获得了人类诱导多能干细胞(hiPSC)，同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导成纤维细胞转化为具有人类胚胎干细胞(hESC)基本特征的hiPSC，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择出了POU5F1、SOX2、NANOG、LIN28A等4个基因进行转导(Takahashi,Ketal.,2007；.Yu,Jetal.，2007)。2009年，中国科学家周琪研究组、高绍荣研究组以及美国Baldwin研究组通过四倍体补偿技术获得了完全由iPSC发育而来的小鼠，证明了iPSC具有与ESC同样的发育潜能(Bolandetal.,2009；Kangetal.,2009；Zhaoetal.,2009)。由于向供体细胞转导外源基因使用的病毒载体会在重编程过程中对其产生一定影响，通过此类方法筛选获得的克隆中存在基因重排、核型异常、表观遗传学异常等现象，甚至具有高危致癌几率。2008年，Okita等人通过多次常规质粒转染的方法获得了小鼠iPSC，但操作麻烦、重编程效率低下(Okita,Ketal.,2008)。同年，Stadtfeld等人首次使用由腺病毒载体衍生的复制缺陷型载体生成无整合的iPSC。他们成功地在小鼠肝脏细胞中表达此种载体携带的外源OSKM基因，并得到了无外源基因整合的iPSC。但是在重编程胎鼠肝细胞及成体成纤维细胞时，必须在稳定反式表达外源Oct4基因的前提下转染携带SKM基因的载体，才能得到iPSC(Stadtfeld,Metal.,2008)。2009年，Fusaki团队利用基于仙台病毒(Sendaivirus，一个RNA病毒)的载体将不同类型的终末分化细胞重编程为hiPSC。但这种方法诱导获得的iPSC内仍然含有此病毒载体，并且在多次传代后仍然可能在细胞内存在，不易删除。在多次传代后筛选到的不含此载体的iPSC克隆由于长时间异位表达Myc基因，可能会导致其核型异常(Fusaki,Netal.,2009)。另外Zhou等人于2009年以蛋白质OSKM与一个精氨酸的细胞膜转导结构域融合，在大肠杆菌中表达并提纯了融合蛋白、将这些融合蛋白转导入含Oct4-GFP报告基因的MEF中，获得了绿色荧光蛋白阳性的克隆，这种方法避免将外源性基因材料引入重编程细胞中，但最大缺陷在于效率低下，重编程所需时间长，并且需耗费很大精力用以提纯高剂量的融合蛋白(Zhou,Hetal.,2009)。2009年，Kaji等人利用脂质体包裹携带DNA的一种特殊载体系统重编程了小鼠成纤维细胞，在这载体两侧插入了loxP位点，在完成诱导后通过瞬时表达Cre重组酶而删除此重编程构件。这一系统的优点在于，在重编程完成后可对外源基因进行删除，其结果可能会提高iPSC的再分化潜能(排除外源基因干扰)，更重要的是可以避免重编程因子的激活，从而降低了肿瘤生成的风险。缺点是使用此系统的重编程因子去除效率极低，并且在删除重编程构件后，在Cre重组酶切除loxP位点后，细胞内仍残留含loxP位点的载体(Kaji,Ketal.,2009)。基于这些原因，Woltjen在内的研究者尝试使用了转座子系统：即同时使用携带目的基因的piggyBac转座子及转座子酶对供体细胞进行了重编程，并成功获得了iPSC。转座子系统不仅能精确切除目的基因，并且在切除后无残留，但重编程因子去除效率低下，同时使用转座子酶具有一个表达时间窗口，需要严格控制其表达时间，否则会因为多轮剪切整合导致非保守删除(Woltjen,Ketal.,2009)。2009年，Yu等人利用OriP/EBNA1游离型载体首次获得了无外源基因污染的人类诱导多能干细胞，即“无痕”hiPSC。此方法只需一次转染，操作简单，而且游离型载体在hiPSC扩增时会自动的从细胞内去除。但初始的OriP/EBNA1游离载体重编程方法效率低下，而且需滋养层细胞，不利于hiPSC的规模化制备以及临床级hiPSC的制备。利用在重编程特定时间段添加小分子化合物与相关细胞因子，OriP/EBNA1游离型载体重编程系统于2011年，实现了从不同种类成体细胞高效制备“无痕”hiPSC，且无需滋养层细胞(Yu,Jetal.,2009；Yu,Jetal.,2011)。目前，iPSC的生成大多依赖于使用逆转录病毒或慢病毒载体，这些载体在完全重编程的iPSC中可以发生转录沉默。但是，部分重编程的iPSC则无法沉默外源性病毒转基因的表达，因此，会影响iPSC的分子特征，包括与ESC的相似度；此外还会增加致瘤性的安全隐患，极大地限制了其在临床上的应用。如何提高体细胞重编程的效率，一直是该领域科研人员的研究主题之一。提高iPSC制备的效率，使制备的iPSC更加安全有效，是iPSC得以应用亟需解决的问题。提高体细胞重编程的效率最直接有效的方式就是通过优化重编程质粒，以提高质粒的制备效率、质粒的转染效率、质粒携带基因的表达水平，并消除基因沉默效应以延长基因表达的持续时间。同时提高重编程质粒的安全性也是重编程iPSC应用于临床的必要条件。质粒是对哺乳动物细胞进行基因编程的有效工具，为了在细菌细胞中扩增和制备，质粒需要包含一段细菌序列，这段序列由复制起始点和抗性筛选基因组成。质粒的复制起始点决定了质粒拷贝数的高低，即质粒的产量。质粒通常含有来源于pMBl、ColEl或pBR322的复制起始点序列，在此基础上对拷贝数调控区域序列的突变可以提高质粒的拷贝数。虽然现有技术已经得到各种高拷贝质粒，但由于细菌基因有横向转移的可能，而这些复制起始点能在多数细菌内介导质粒的复制，因此存在质粒转移并在患者体内菌群中复制的隐患。质粒的筛选标记通常是抗生素抗性基因，但质粒制备过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，通过非抗生素筛选的游离型质粒载体重编程血液细胞，即得到诱导多能干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，通过非抗生素筛选的游离型质粒载体重编程血液细胞，即得到诱导多能干细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；
(2)将非抗生素筛选的游离型质粒载体导入所述红细胞祖细胞中，得到含有非抗生素筛选的游离型质粒载体的红细胞祖细胞；
(3)将所述含有非抗生素筛选的游离型质粒载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；
(4)待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基，对细胞维持培养，挑取形态类似于人胚胎干细胞的克隆进行扩增培养，接着对细胞进行鉴定，得到诱导多能干细胞。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基配方为：每升扩增培养基包含ITS添加剂10ml、GlutaMAX10ml、LipidConcentrate1ml、L-抗坏血酸2-磷酸化半镁盐水合物250μmol、硫酸亚铁3μmol、硝酸铁0.2μmol、硫辛酸1μmol、氢化可的松1μmol、干细胞因子100μg、促红细胞生成素20μg、白细胞介素-35μg、剩余补充IMDM基础培养基。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导培养基，其组分为在每升扩增培养基的基础上添加一种或多种以下小分子：CHIR990212.5-4μmol、A-83-010.4-0.6μmol和PD03259010.4-0.6μmol。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非抗生素筛选的游离型质粒载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：制备非抗生素筛选的游离型质粒空载体；
步骤2：对包含外源重编程因子的游离型载体进行酶切，得到大小不...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34