具有溶藻活性的假单胞菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有溶藻活性的假单胞菌（

【技术实现步骤摘要】
具有溶藻活性的假单胞菌及其应用
本专利技术属于微生物控藻领域，具体涉及一种具有溶藻活性的假单胞菌及其在控制蓝藻水华中的应用。
技术介绍
近二十年来，我国淡水水体蓝藻水华整体呈现高生物量、大范围、高频次、高危害的特征。形成水华的蓝藻种类主要有微囊藻(Microcystis)、长孢藻(Dolichospermum)、束丝藻(Aphanizomenon)、浮丝藻(Planktothrix)、节球藻(Nodularia)、颤藻(Oscillatoria)等，微囊藻水华是我国最主要的水华类型，长孢藻水华和束丝藻水华次之。蓝藻水华的肆意暴发直接或间接地影响人类健康，并引起水体生态系统结构和功能的失衡，俨然已成为我国当前乃至今后长时期内面临和亟待解决的重大水环境问题。研究和发展控藻抑藻关键技术，促进湖泊向健康稳定方向发展具有重要的理论和现实意义。与常规物理法、化学法控藻技术相比，基于现代生态环保理念的微生物控藻技术具有具有经济、特异、安全、维持水体生态平衡的优势，是一种利用细菌、放线菌、真菌、原生动物及病毒等生物控制藻华以解决水环境问题的生态修复技术。合理利用微生物法控制水华蓝藻，对改善水质、缓解水华危害有着十分重要的意义。纵观国内外的研究，微生物控藻法中报道最多的是利用溶藻细菌控制蓝藻水华。但鉴于其实际溶藻效果易受水体生态系统中各种生物因子、非生物因子影响，且有些微生物的生态安全性有待进一步的科学论证，目前对于溶藻细菌的研究主要集中于分离鉴定、溶藻现象的描述及其溶藻方式、机理方面，对其野外应用方法的研究尚处于初级阶段，少有关于其成功应用的案例。因此，筛选出具有高效溶藻效能的溶藻细菌并初步尝试其实际应用的方法，对水体水华的治理有着十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有溶藻活性的假单胞菌，该菌株具有较高的溶藻效率，将其制成菌体包埋小球用于控制蓝藻水华也具有较好的效果，使用寿命较长，可反复使用，安全环保。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：专利技术人从发生蓝藻水华的太湖采集水样，经分离纯化培养及溶藻效率筛选，得到一株溶藻细菌THW7，为G-菌，短杆状或略弯，长约1.0-8.0μm，宽约0.3-1.0μm。在LB固体平板上形成的菌落呈中央略微凸起的圆球状，乳白色，质地较疏松，易被接种环挑起，表面光滑、不透明、较湿润，边缘整齐。通过16SrDNA测序和形态学鉴定，该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)，命名为假单胞菌(Pseudomonassp.)THW7，已于2019年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20191065。假单胞菌(Pseudomonassp.)THW7在控制蓝藻水华中的应用，其方法如下：(1)收集假单胞菌菌体，洗涤后用无菌水重悬；(2)将假单胞菌重悬液加入3％-4％的海藻酸钠溶液中，搅拌混匀后将混合液逐滴加入3.5％-4.5％的氯化钙溶液，交联反应后获得包埋小球，表面光滑，直径4-6mm；(3)将假单胞菌菌体包埋小球后投入蓝藻水华水体中，并在水体中添加1.0-1.2g/L葡萄糖。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：针对利用溶藻细菌实际控藻中培养耗费大且实际应用时对水体生态系统造成的额外营养负荷问题，本专利技术利用廉价易获得的海藻酸钠和氯化钙交联将菌体包埋，再辅加一定浓度的葡萄糖作为能源补充，投入藻液中进行溶藻实验，不仅对单细胞的铜绿微囊藻具有非常明显的溶藻效果，而且也能够使蓝藻水华显著下沉，是一种有效治理蓝藻水华的方法，提供了治理蓝藻水华的新思路。这种包埋小球收放自如，使用寿命较长，可反复使用，一方面简化了控藻操作流程，降低菌种培养耗费等成本，另一方面减少溶藻过程本身给水体带来的额外营养负荷，相对环保。附图说明图1为溶藻细菌的分离纯化流程图。图2为菌株THW7在LB固体平板上的菌落照片。图3为菌株THW7的透射电镜照片。图4为菌株THW7的16SrDNA序列通过BLAST比对，相关序列于Bioedit7.0.9.1进行序列比对分析，最后用MEGA6.0、采用邻接法(Neighbor-joining，重复度F1000)构建的系统发育树。图5为菌株THW7的生长曲线。图6为THW7菌体的包埋小球照片。图7为单细胞铜绿微囊藻中投加THW7菌体的包埋小球后，第10d三角瓶中藻液的照片。图8为THW7菌体的包埋小球对单细胞铜绿微囊藻的溶藻效率柱状统计图。图9为野外群体藻样中投加THW7菌体的包埋小球后，藻液叶绿素a浓度变化的柱状图。图10为野外群体藻样中投加THW7菌体的包埋小球后，三角瓶中藻液在7d时的照片。图11为野外群体藻样中投加THW7菌体的包埋小球后，三角瓶中藻液在20d时的照片。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的具体实施方法进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：假单胞菌(Pseudomonassp.)THW7的分离纯化及培养1.假单胞菌THW7的分离纯化与保藏溶藻细菌的分离纯化流程如图1所示。从太湖采集蓝藻水华水样，经0.8μm的滤膜(Millipore)过滤，上清用无菌水进行10倍梯度稀释(稀释级别视具体情况而定)，取100μL各梯度的稀释液均匀涂布于LB固体平板，每个梯度三个平行，写上对应编号，于生化培养箱中30℃倒置培养48h。选取菌落分布较为均匀的平板，挑取不同形态的单菌落在LB固体平板分区划线分离纯化两次，得到纯培养的菌株，用甘油保藏法保存在-80℃冰箱。挑取单克隆接种于LB固体斜面，待细菌菌落长出，用无菌水冲刷，吹打均匀制成菌苔洗脱液。以10％的体积比添加菌苔洗脱液到铜绿微囊藻(MicrocystisaeruginosaPCC7806)藻液中，空白对照组藻液中加入等体积的无菌水，于24孔板中进行共培养。置于光照培养箱中，培养温度为25℃、光强为25μE、光暗周期比为12h∶12h。5d后观察，若藻液黄化则该菌为溶藻菌。根据初筛结果，挑取溶藻菌的单克隆接种于LB液体培养基，于控温摇床中30℃、140rpm培养48h，以10％的体积比将细菌培养物添加到铜绿微囊藻(MicrocystisaeruginosaPCC7806)藻液中，以加入等体积的无菌水作为空白对照组，于100mL三角瓶中进行共培养。置于光照培养箱中，培养条件同上，6d后测定其叶绿素a的含量，计算溶藻效率。溶藻效率的计算公式如下：溶藻效率(％)＝[(C0-C)/C0]×100％公式中C0为处理组初始的叶绿素a浓度，C为处理组测定时的叶绿素a浓度。通过以上方法，筛选出一株溶藻效率较高的菌株，该菌株在第6天的溶藻效率为84.61％，编号THW7。菌株THW7在LB固体平板上的菌落形态如图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有溶藻活性的假单胞菌（

【技术特征摘要】
1.一种具有溶藻活性的假单胞菌（Pseudomonassp.），其特征在于，所述假单胞菌的保藏编号是CCTCCNO:M20191065。


2.含有权利要求1所述的假单胞菌的包埋小球。


3.权利要求2所述的假单胞菌包埋小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）收集假单胞菌菌体，洗涤后用无菌水重悬；
（2）将假单胞菌重...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘南琴，宋立荣，陈莉婷，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42