一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂及其制备方法与应用。所述的微球制剂是结合巨噬细胞靶向肽和B细胞淋巴瘤6因子抑制肽的双靶向制剂；其是将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽负载于脂质体，得到B细胞淋巴瘤6因子抑制肽‑脂质体溶液；再将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽‑脂质体溶液与巨噬细胞靶向肽结合，即得。本发明专利技术首次将巨噬细胞的靶向肽与胞内信号分子抑制剂结合在一起，荷载于纳米微球，制备成定向转移至肿瘤微环境的免疫制剂。另外，本发明专利技术首次发现该制剂能够显著降低肺癌肿瘤中巨噬细胞的比例和数量，逆转其干细胞样表型，制剂能够显著抑制肺癌肿瘤的大小和重量，具有明显抗肿瘤作用。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂及其制备方法与在制备抗肿瘤产品中的应用。
技术介绍
肿瘤是目前全球性公共健康的难题，是威胁人类健康的重大问题，其发病率和死亡率逐年增高，减缓或抑制肿瘤的发病进展成为当下肿瘤治疗的主要目标。现有研究已明确肿瘤的形成发展与其所处的肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)密切相关。TME不但为肿瘤生长提供必要的营养物质、生长条件和物理基质，而且通过改造和驯化浸润其中的免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞等，使之发生表型、功能转变或效应细胞耗竭，以形成有利于肿瘤免疫逃逸和促进其生长的局部小环境(niche)。基于此，目前以解除免疫抑制为目的肿瘤免疫疗法如PD-1免疫检查点抑制剂和CAR-T等受到广泛关注，其被认为是继手术、化疗和放疗等传统肿瘤治疗方法之外，具有重要应用前景和巨大潜力的新的肿瘤治疗技术。尽管如此，现有肿瘤免疫治疗方法多集中于T细胞，而T细胞的活化和功能发挥受抗原提呈细胞如树突状细胞(DCs)和巨噬细胞等作用，因此，以巨噬细胞为靶向的免疫调控药物和治疗方法正成为新的肿瘤免疫治疗研究方向。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，TAMs)是肿瘤微环境的主要组成部分，其在肿瘤组织中比例甚至可达到50％以上。大量临床证据表明，TAMs的数量与肿瘤发生、发展、转移和侵袭等具有密切关系，与肿瘤治疗效果和病人预后呈负相关，且与目前肿瘤免疫治疗方法如PD-1抑制剂的疗效具有反比关系。我们和其他研究者的研究结果显示，TAMs在肿瘤作用下，分化为具有特定表型和功能的细胞亚型，表现为细胞增殖、存活和自我复制能力显著增强，分泌免疫抑制和促癌细胞因子水平显著上升，具有直接或者间接促进肿瘤的形成发展的作用，是极具吸引力的肿瘤免疫治疗靶标。目前，针对TAMs的肿瘤免疫治疗策略方面，包括清除TAMs、干扰TAMs功能、重编程TAMs表型等，虽已取得一定的进展，但仍然存在不少问题需要解决。如不少基于TAMs清除目的的治疗方法缺乏肿瘤靶向性，对肿瘤微环境的渗透性较低而导致疗效不佳。而更为重要的是，因为巨噬细胞本是机体固有免疫的核心组成部分，具有抗感染、免疫调节、组织修复和维持机体平衡等重要作用，非特异性清除或普遍性重编巨噬细胞表型功能无疑对于保证抗肿瘤安全性和有效性来说是不利的，寻求机制清楚、作用靶标特异、去免疫抑制效果TAMs。B细胞淋巴瘤6因子(Bcelllymphoma6,Bcl6)是一具有多种调节活性的转录因子。其结构包含N端BTB/POZ区域和C末端的6个kruppel样锌指结构。Bcl6通过与靶基因启动子区域特定DNA序列结合儿调控其转录和表达。Bcl6靶基因涉及细胞活化、分化、发育、凋亡、增生和细胞能量代谢等众多关键分子，参与免疫、炎症、肿瘤、发育等多种生理病理过程。本研究前期显示，Bcl6诱导性高表达于TAMs，并导致TAMs逆分化成为具有干细胞样、具有促肿瘤记忆的巨噬细胞表型。研究显示，Bcl6通过基因转录调控作用，促进巨噬细胞增殖、抗凋亡、自我复制和分泌免疫抑制细胞因子能力增加，是肿瘤微环境中TAMs长期存活、数量增加和肿瘤清除能力受制的重要原因。干扰Bcl6表达已显示显著的抗肿瘤体内效应，因此，Bcl6有望成为以肿瘤相关巨噬细胞靶向的，以逆转免疫抑制为目标的抗肿瘤免疫治疗的潜在分子靶标。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中抗肿瘤免疫疗法中以肿瘤相关巨噬细胞为靶向、以特异性逆转免疫抑制为目的的有效靶标、技术思路和方法手段的不足，提供一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂，其具有细胞和分子双靶向的、可定向转移至肿瘤微环境、有效提高抗肿瘤免疫效应。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂在制备抗肿瘤产品中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂，其是以纳米微球为载体，结合巨噬细胞靶向肽(Mp)和B细胞淋巴瘤6因子(Bcl6)抑制肽的双靶向免疫纳米微球制剂，其通过肿瘤微环境的高效靶向，逆转肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的免疫抑制作用，有效遏制肿瘤进展，具有显著的抗肿瘤效应。其中，所述的巨噬细胞靶向肽(Mp)的氨基酸序列为YEQDPWGVKWWY；所述的B细胞淋巴瘤6因子(Bcl6)抑制肽的氨基酸序列为GEGIEHISR。上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂的制备方法也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的制备方法为将Bcl6抑制肽(Bi)负载于脂质体表面，得到Bi-脂质体溶液；再将Bi-脂质体溶液与Mp结合，两者在pH2-4的酸性条件下混合，即得。其中，所述的Bi-脂质体溶液的制备方法为将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽溶解于PBS缓冲液中，加入磷脂薄膜，室温震荡水化，匀化粒径，透析，去除游离态，即得。其中，所述的磷脂薄膜的制备方法为将磷脂与胆固醇溶于三氯甲烷中，除干溶剂，即得；其中，磷脂、胆固醇和三氯甲烷的用量比为60mg：10mg：4mL。其中，B细胞淋巴瘤6因子抑制肽与PBS缓冲液的用量比为1-4mg/mL，优选2.5mg/mL；控制磷脂薄膜的用量使磷脂与B细胞淋巴瘤6因子抑制肽的摩尔比为40:1-8:5，优选8:1。其中，所述的震荡水化的时间为30min。其中，所述的匀化粒径为采用探头进行超声，优选200W×10次。其中，所述的将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽-脂质体溶液与巨噬细胞靶向肽结合包括如下步骤：(1)将巨噬细胞靶向肽溶于PBS缓冲液中，用HCl调节溶液的pH为2-4，优选3.5；(2)将步骤(1)得到的溶液与B细胞淋巴瘤6因子抑制肽-脂质体溶液混合，HCl调节使其pH保持在3.5酸性条件，室温震荡30min，即得。步骤(1)中，巨噬细胞靶向肽与PBS缓冲液的用量比为1-4mg/mL，优选3.3mg/mL。步骤(2)中，控制步骤(1)得到溶液与B细胞淋巴瘤6因子抑制肽-脂质体溶液的用量，使巨噬细胞靶向肽与磷脂的摩尔比为1:50-1:200，优选1:50。上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂在制备抗肿瘤产品中的应用也在本专利技术的保护范围之内；优选地，所述的肿瘤为肺癌。其中，所述的抗肿瘤是通过免疫调节微球制剂特异性剔除肿瘤相关巨噬细胞，抑制肿瘤相关巨噬细胞的干性转化和增殖能力，改善免疫抑制肿瘤微环境的作用，其可显著抑制体内肿瘤生长和进展，在肺癌等肿瘤防治中具有潜在应用价值。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：(1)本专利技术首次将巨噬细胞的靶向肽与胞内信号分子抑制剂结合在一起，荷载于纳米微球，制备成定向转移至肿瘤微环境的免疫制剂。(2)实验结果显示制剂能够显著抑制肺癌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂，其特征在于，所述的微球制剂是结合巨噬细胞靶向肽和B细胞淋巴瘤6因子抑制肽的双靶向制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂，其特征在于，所述的微球制剂是结合巨噬细胞靶向肽和B细胞淋巴瘤6因子抑制肽的双靶向制剂。


2.权利要求1所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂的制备方法，其特征在于，将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽负载于脂质体，得到B细胞淋巴瘤6因子抑制肽-脂质体溶液；再将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽-脂质体溶液与巨噬细胞靶向肽结合，即得。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的B细胞淋巴瘤6因子抑制肽-脂质体溶液的制备方法为将B细胞淋巴瘤6因子抑制肽溶解于PBS缓冲液中，加入磷脂薄膜，震荡，即得。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，B细胞淋巴瘤6因子抑制肽与PBS缓冲液的用量比为1-4mg/mL。


5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，控制磷脂薄膜的用量使磷脂与B细胞淋巴瘤6因子抑制肽的摩尔比为40:1-8:5。


6.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：史丽云，陈志鹏，张伟伟，王晶晶，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32