用于去除和/或检测具有错配的核苷酸的核酸的方法技术

本文提供了各种体外方法，除其他事项外，这些方法涉及使用EndoMS切割包含错配的核苷酸的dsDNA分子。在一些实施方式中，方法可包括将加T尾的双链衔接子与核酸的加A尾的双链片段连接，以产生包含衔接子连接的片段和在连接接点处包含T:T错配的双链衔接子二聚体的连接产物，和使用EndoMS切割衔接子二聚体的两条链。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于去除和/或检测具有错配的核苷酸的核酸的方法
技术介绍
在下一代DNA测序过程中，通常将待测序的DNA分子剪切成片段，进行修复，并且将已知序列的衔接子连接至插入片段(insert)文库。DNA测序样品制备中的关键步骤是寡核苷酸衔接子与DNA片段群体的连接。DNA片段通常在3'尾部加有dA，以防止文库DNA的自连接。衔接子被设计具有3'-T突出端(overhang)以优先连接至片段的3'-dA。在连接过程中，衔接子相对于片段是过量的，以最大化连接效率。通常，建议摩尔比为10:1的衔接子：插入片段(insert)，以最大化连接效率(Head,etal.,Biotechniques,2014,56,61-68)。但是，使用较高的衔接子：片段比导致“衔接子二聚体”，这是由于衔接子直接彼此自连接而不是与文库插入序列直接连接。如果输入样品量低或质量差，诸如来自活检、FFPE、组织或单细胞的DNA或cDNA，则衔接子二聚体的问题会被放大(Head2014)。在低DNA输入或低质量输入的情况下，衔接子：插入片段的比大于10:1(例如100:1、1000:1或10,000:1)并导致更多的衔接子二聚体和低的文库转换效率。衔接子二聚体在小RNA文库制备过程中也是有问题的，并且形成连接的DNA产物的大部分(Shore,etal.,PLoSOne,2016,11,e0167009)。一旦形成，衔接子二聚体在PCR期间比包含较长插入片段的文库更有效地扩增。由于其尺寸短，衔接子二聚体在测序流通池(sequencingflowcells)上非常有效地形成簇。但是，由于衔接子二聚体不包含插入片段，因此对衔接子二聚体进行测序不产生有用的数据。在Illumina测序操作(运行，run)中，低水平(5％)的衔接子二聚体污染可导致60％的测序读取(reads)来自衔接子二聚体。因此，衔接子二聚体污染降低了DNA测序质量和产量，并增加了测序成本。为了使样品制备过程中DNA衔接子二聚体的形成和积累最小化，已经开发了几种策略，将衔接子二聚体从插入片段连接至衔接子的文库中分离。例如，可使用珠子(beads)去除衔接子二聚体。可选地，可以通过凝胶电泳，将连接的DNA文库与衔接子二聚体分离，并切出与该文库对应的条带并从凝胶中纯化。其他方法包括使用封闭式(blocking)锁定核酸(LNA)减少衔接子二聚体连接(Kawano,etal.,Biotechniques,2018,49,751-755)。然而，这些方法导致整体样品损失并限制自动化构建文库(Shore,etal.,MethodsinMolecularBiology,2018,v.1712,pp145-161)。US2014/0356867描述了使用Cas9切割(裂解，cleavage)衔接子二聚体。但是，此出版物中没有描述衔接子二聚体的主要来源——包含T-T错配的衔接子二聚体。此外，不仅指导RNA与基因组序列可能杂交以产生不希望的脱靶切割，而且将指导RNA分子引入扩增和/或测序反应中可潜在地引起其他人为现象(假象，artefacts)。在另一实例中，WO2013/188037描述了一种方法，通过该方法，将CRISPR茎环改造成RNA衔接子，使得那些衔接子的二聚体可以被Cas6识别，并在逆转录之前被切割。WO2013/188037没有提及包含T-T错配的衔接子二聚体或DNA衔接子。鉴于上述情况，需要消除衔接子二聚体的方法，以实现高质量的DNA测序，尤其是在低输入情况下。减少或消除衔接子二聚体，将使正常的和低的输入文库均具有更高的文库转换效率，这是由于:1)更高的衔接子：插入片段的比提高了连接效率，以及2)在衔接子二聚体不存在的情况下，文库的PCR效率更高，导致DNA测序的质量和产量更高。
技术实现思路
用于构建下一代测序文库的许多衔接子具有单个核苷酸3'突出端。从理论上讲，此类衔接子仅能与包含单个核苷酸3'A突出端的其他分子连接，前提是该衔接子突出端与A互补。与A互补的核苷酸被称为T。衔接子不应与含有单个核苷酸3'T突出端的其他分子连接。贯穿本说明书和权利要求，“T”包括类似物，如U以及修饰的T和修饰的U。已经发现，在下一代测序文库构建过程中产生的衔接子二聚体通常在连接接点(连接接合，ligationjunction)处包含T:T错配。使用本文所述的EndoMS可以有效地消除这些分子。仅在双链DNA(dsDNA)包含错配的情况下，EndoMS才特异性切割双链DNA的两条链。在一些实施方式中，EndoMS处理步骤可另外地从样品中去除含有损伤的核苷酸的分子。本文描述了各种方法和试剂盒。在一些实施方式中，用于切割在连接反应过程中产生的衔接子二聚体的方法可包括：(a)将加T尾的(T-tailed)双链衔接子与核酸的加A尾的(A-tailed)双链片段连接，以产生包含以下的连接产物：i)衔接子连接的双链核酸片段和(ii)在连接接点处包含T:T错配的双链衔接子二聚体；(b)使用EndoMS切割衔接子二聚体的两条链。还提供了用于切割核酸的方法。在一些实施方式中，方法可包括:使核酸和与核酸内的靶序列不完全互补的寡核苷酸杂交，以产生包含一个或多个单核苷酸错配的双链体；和用EndoMS处理双链体，从而在含有单核苷酸错配的靶序列处切割核酸。还提供了用于识别双链核酸中的单个错配的核苷酸的方法。在这些实施方式中，方法可包括:(a)使包含双链核酸的样品与EndoMS反应，以产生反应产物，其中EndoMS仅在核酸包含错配时切割核酸的两条链；(b)如果核酸未被切割，则在使双链核酸扩增的条件下，使(a)的反应产物进行扩增；和(c)检测扩增产物的存在，其中产物的存在指示双链核酸不具有错配的核苷酸，而产物的不存在指示所述双链核酸具有错配的核苷酸。其他实施方式可包括使用EndoMS来靶向纯化的基因组DNA中的错配。其他实施方式可包括利用通过使用额外的染色体DNA进行转化而递送的古细菌EndoMS基因的细菌，来靶向真核细胞中的核酸内的体内错配。可选地，可以利用脂质体或本领域已知的各种转运蛋白，在真核细胞中体内递送EndoMS蛋白。附图说明本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于示例目的。附图不意图以任何方式限制本教导的范围。图1A-1BEndoMS消除了具有错配的双链寡核苷酸。图1A显示了使用的双链寡核苷酸的序列。图1B显示了EndoMS与T:A或T:T底物温育各种不同的时间(0-60分钟)，并用10mMEDTA停止反应。将反应分离，并通过毛细管电泳进行分析。EndoMS在匹配的T:A底物上没有活性，但对于T:T错配5'的两个核苷酸(nt)进行切割，从而产生较小的9nt产物。该数据显示EndoMS能够有效消除包含错配的双链寡核苷酸。图2A-2B显示EndoMS切割T:T衔接子二聚体错配。衔接子被连接，并产生在连接的衔接子接点处具有T:T错配的衔接子二聚体。图2A显示了通过将加T尾的发夹寡核苷酸连接在一起而产生的衔接子二聚体的结构。图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于切割在连接反应中产生的衔接子二聚体的方法，包括：/n(a)将加T尾的双链衔接子与核酸的加A尾的双链片段连接，以产生包含以下的连接产物：(i)衔接子连接的双链核酸片段和(ii)在连接接点处包含T:T错配的双链衔接子二聚体；/n(b)使用EndoMS切割所述衔接子二聚体的两条链。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170628 US 62/525,8031.用于切割在连接反应中产生的衔接子二聚体的方法，包括：
(a)将加T尾的双链衔接子与核酸的加A尾的双链片段连接，以产生包含以下的连接产物：(i)衔接子连接的双链核酸片段和(ii)在连接接点处包含T:T错配的双链衔接子二聚体；
(b)使用EndoMS切割所述衔接子二聚体的两条链。


2.权利要求1所述的方法，进一步包括(c)扩增所述衔接子连接的双链核酸片段。


3.权利要求2所述的方法，其中所述扩增是使用与所述连接的衔接子杂交的引物或其互补序列来完成的。


4.权利要求2或3所述的方法，其中所述方法是在不按尺寸富集所述衔接子连接的双链核酸片段的情况下进行的。


5.任一前述权利要求所述的方法，其中所述双链核酸片段是基因组片段。


6.任一前述权利要求所述的方法，其中所述加T尾的双链衔接子是Y衔接子或一对Y衔接子。


7.任一前述权利要求所述的方法，其中所述加T尾的双链衔接子是环衔接子。


8.任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括温育包含所述加T尾的双链衔接子、核酸的所述加A尾的双链片段、连接酶和所述EndoMS的反应混合物，以产生所述连接产物，和切割所述衔接子二聚体的两条链。


9.任一前述权利要求所述的方法，其中所述EndoMS是热稳定的。


10.试剂盒，其包括：
(a)加T尾的双链衔接子；和
(b)EndoMS酶。


11.权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含连接酶。


12.权利要求10-11中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含反应缓冲液。


13.方...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·F·加德纳，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：美国;US