用于三磷酸核苷和核糖核酸生成的方法和组合物技术

在一些实施方案中，本文中提供了用于生成三磷酸核苷和核糖核酸的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于三磷酸核苷和核糖核酸生成的方法和组合物相关申请本申请要求2017年10月11日提交的美国临时申请号62/571,071的35U.S.C.§119(e)下的权益，其通过引用完整并入本文。专利技术背景核糖核酸(RNA)包含核糖核苷酸的重复单元，并在关键的细胞过程中起作用，包括基因表达和蛋白质合成。因此，RNA是用于调控细胞基本过程的有吸引力的靶标，例如，诱导细胞免疫应答的RNA疫苗。然而，以商业规模(例如，克至千克)低成本生成RNA部分由于起始材料(例如，三磷酸核苷(NTP))和反应成分(例如，DNA模板和聚合酶)的成本而是挑战性的。以商业相关规模提供高质量RNA需要NTP和RNA两者的有成本效益的生成。专利技术概述本文中提供了利用生物合成途径来低成本生成(生物合成)NTP和/或RNA的系统、方法、组合物(例如细胞、细胞裂解物、试剂和反应混合物)和试剂盒，所述生物合成途径开发为利用低成本底物(例如细胞RNA、核碱基、核苷、单磷酸核苷(NMP)和/或二磷酸核苷(NDP))、重组和/或内源酶(例如激酶和/或聚合酶)和能源(例如NTP、多磷酸盐和/或焦磷酸盐)。在一些实施方案中，NTP和/或RNA的生成是使用体外和/或无细胞的裂解物系统实现的，所述裂解物系统被设计为最小化(例如减少，抑制和/或去除)不想要的酶促活性，从而提高了过程效率和期望的终产物的产率。本文中所述的生物合成途径通常利用多磷酸激酶和多磷酸盐作为内源途径酶和磷酸盐源的替代物。因此，本公开内容的一些方面提供了用于生成NTP的方法和组合物，其包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育NDP(例如，ADP、CDP、GDP和/或UDP)、多磷酸激酶(例如，PPK2)和多磷酸盐(例如六偏磷酸盐)。如图2A所示，PPK将磷酸盐从多磷酸盐转移到ADP、CDP、GDP和UDP，从而生成ATP、CTP、GDP和UTP。在一些实施方案中，此反应混合物进一步包含NDP激酶(例如，ndk)。本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育NMP(例如5′-NMP，例如5′-AMP、5′-CMP、5′-GMP和/或)、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NMP激酶或NDP激酶(例如，ndk)。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含NMP激酶(例如，adk、cmk、gmk和/或pyrH)和NDP激酶(例如，ndk)。本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括在适合于生成NTP的条件在反应混合物中温育核苷(例如，腺苷、胞苷、鸟苷和/或尿苷)、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶或NDP激酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和NDP激酶。本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育核碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和/或尿嘧啶)、磷酸核糖转移酶、磷酸核糖基焦磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶或NDP激酶。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核苷激酶、NMP激酶和NDP激酶在一些实施方案中，从细胞RNA生成用于NTP的生物合成的起始材料(例如，NMP、NDP和/或核苷)。因此，本公开内容的一些方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括(a)在适合于生成二磷酸核苷(NDP)的条件下在反应混合物中温育细胞RNA(例如，获自单细胞或多细胞生物体)、多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)和无机磷酸盐；(b)消除PNP酶(并任选消除其他不想要的酶促活性)；(c)在适合于生成NTP的条件下在所得反应混合物中温育NDP、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，步骤(c)的反应混合物进一步包含NDP激酶。或者，方法可包括(a)在反应混合物中在适合于生成二磷酸核苷的条件下温育细胞核糖核酸(RNA)、PNP酶、无机磷酸盐、多磷酸激酶和多磷酸盐(任选地，其中反应混合物进一步包含NDP激酶)；(b)消除PNP酶；并且(c)在适合于生成NTP的条件下温育反应混合物。在一些实施方案中，所需的途径酶(例如，多磷酸激酶和/或NDP激酶)能经受住消除条件(例如，暴露于高温或化学抑制剂)，从而它们在暴露于用于消除(例如，减少，抑制和/或去除)PNP酶的条件后保留其活性(例如，至少50％的其活性)。本公开内容的其他方面提供了用于生成NTP的系统、方法、组合物和试剂盒，其包括(a)在适合于生成NMP(例如5′-NMP)的条件下在第一反应混合物中温育细胞RNA和核糖核酸酶(RNA酶，例如RNA酶R或核酸酶P1)；(b)消除RNA酶(和任选地其他不想要的酶促活性)；并且(c)在适合于生成NTP的条件下在所得反应混合物中温育NMP、多磷酸激酶和多磷酸盐。在一些实施方案中，步骤(c)的反应混合物进一步包含NMP激酶、NDP激酶或NMP激酶和NDP激酶两者。或者，方法可以包括：(a)在反应混合物中在适合于生成NMP(例如5′-NMP)的条件下温育细胞RNA、RNA酶、多磷酸激酶和多磷酸盐；(b)消除RNA酶；并且(c)在适合于生成NTP的条件下温育反应混合物。在一些实施方案中，本文中生成的NTP用于生成RNA(例如，mRNA或双链RNA)。如本文所述，这可以例如通过将DNA模板和聚合酶(例如，T7RNA聚合酶)添加到用于生成NTP的任何反应混合物中来实现。或者，可以将NTP分离并在单独的反应混合物中与DNA模板和聚合酶组合以生成RNA。因此，本公开内容还提供了用于生成RNA的方法和组合物。在本文所述的任何生物合成途径中，当用作起始底物时，核碱基、核苷、NMP、NDP或NTP可以是化学合成的，发酵产物或通过其他手段生成的。在本文中描述的系统、反应混合物和方法中使用的多磷酸激酶可以选自表2或12中列出的任何多磷酸激酶。在一些实施方案中，多磷酸激酶包含来自地热异常球菌的III类多磷酸激酶2。多磷酸盐可以是充当途径酶的底物的任何多磷酸盐。在一些实施方案中，多磷酸盐是六偏磷酸盐。在使用细胞RNA的实施方案中，细胞RNA包括例如核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA。细胞RNA可以来自单细胞生物体(例如细菌或酵母)或多细胞生物体(例如植物)。本公开内容中有用的生物合成途径的酶可以获自(分离和/或纯化)(至少一种)细胞裂解物，所述细胞裂解物从例如表达该途径的酶(例如核酸酶(例如RNA酶和/或PNP酶)、多磷酸激酶、NMP激酶、NDP激酶和/或聚合酶)的细胞(例如工程化细胞)制备。本文描述了用于制备这些细胞裂解物的示例性方法。或者，反应混合物可包含从表达途径酶的细胞(例如，工程化细胞)制备的细胞裂解物(单细胞裂解物或细胞裂解物的混合物)。也就是说，可以在细胞裂解物或细胞裂解物的混合物中进行完全反应，所述细胞裂解物或细胞裂解物的混合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：/n在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含一种或多种NDP激酶。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171011 US 62/571,0711.一种用于生成三磷酸核苷(NTP)的方法，其包括：
在适合于生成NTP的条件下在反应混合物中温育二磷酸核苷(NDP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含一种或多种NDP激酶。


2.权利要求1的方法，其进一步包括：
在适合于生成所述NDP的条件下在反应混合物中温育5’单磷酸核苷(5’NMP)、多磷酸激酶和多磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含一种或多种NMP激酶。


3.权利要求1或2的方法，其进一步包括：
(a)在适合于生成所述5’NDP的条件下，在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和多核苷酸磷酸化酶(PNP酶)以及无机磷酸盐，任选地其中所述反应混合物进一步包含解旋酶；或者
(b)在适合于生成所述5’NMP的条件下，在反应混合物中温育细胞核糖核酸(RNA)和核糖核酸酶。


4.权利要求1-3中任一项的方法，其包括：
在适合于生成感兴趣RNA的条件下在反应混合物中温育所述NTP、编码所述感兴趣RNA的DNA模板和RNA聚合酶。


5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述NDP包含ADP、GDP、CDP和/或UDP。


6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述NDP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。


7.权利要求2-6中任一项的方法，其中所述5′NMP包含5′AMP、5′GMP、5′CMP和/或5′UMP。


8.权利要求2-7中任一项的方法，其中所述5'NMP是化学合成的，发酵的产物或从天然来源提取的。


9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶选自PPK1或PPK2家族酶，任选地其中所述多磷酸激酶(PPK)包含来自地热异常球菌(Deinococcusgeothermalis)的III类PPK2(SEQIDNO.:1)。


10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述多磷酸盐包括六偏磷酸盐。


11.权利要求1-10中任一项的方法，其中
(a)从表达或生成所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述PNP酶、所述核糖核酸酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶的细胞制备所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述一种或多种NDP激酶、所述PNP酶、所述核糖核酸酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶；或者
(b)所述反应混合物包含来自表达或生成所述多磷酸激酶、所述一种或多种NMP激酶、所述NDP激酶、所述PNP酶、所述核糖核酸酶、所述DNA模板和/或所述RNA聚合酶的细胞的细胞裂解物或酶制备物，任选地其中已经消除所述细胞裂解物中的酶的天然酶促活性，并且任选地其中已经经由遗传修饰、从细胞的酶分泌、蛋白酶靶向、温度、pH、盐、去污剂、醇、化学抑制剂、分离、沉淀、过滤、捕获和/或层析消除所述细胞裂解物中酶的天然酶促活性。


12.权利要求11的方法，其中所述天然酶促活性选自磷酸酶、核酸酶、蛋白酶、脱氨酶、氧化还原酶和水解酶。


13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述多磷酸激酶、一种或多种NMP激酶和/或一种或多种NDP激酶能经受住消除条件。


14.权利要求3-13中任一项的方法，其中所述细胞RNA包括核糖体RNA、信使RNA和/或转移RNA，并且任选地其中所述细胞RNA来自单细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：DS坎宁安，D麦凯克伦，H达曼卡，I艾沃丘库，JR阿布希尔，M古普塔，ME莫拉，N苏德哈桑，N斯基齐姆，R杰恩，K拉玛钱德里亚，
申请(专利权)人：绿光生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US