分离核酸的方法技术

本公开涉及一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法，该方法包括：(a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下，将样品暴露于热塑性聚合物基质；(b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下，洗涤(a)中结合核酸的基质；以及(c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液，从而从基质中回收核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离核酸的方法
本专利技术总体上涉及一种分离核酸的方法，特别是一种从例如细胞裂解物的生物材料中分离核酸的方法。
技术介绍
核酸(NA)的分离并非不重要，因为任何DNA/RNA测定法的性能都取决于NA输入的质量8。在医疗点(POC)应用中，由于现场可用资源的限制，NA分离过程更加复杂。例如，大多数常规的基于实验室的NA分离方案(基于Boom方法9)通常都需要使用离心机(例如，基于二氧化硅旋转柱的方法9，10)。但是，在偏远地区或基于家庭的NA测定法中，可能无法使用离心机。因此，已经提出了各种策略来规避这种资源限制。一个示例是固相可逆的固定(SPRI)11方法，该方法最近得到普及11-15。SPRI通常基于NA在表面(例如微粒)上的沉淀，然后在酒精洗涤后可以将其重新悬浮在相容的缓冲液中。SPRI需要最少的设备，因此更适合POC应用。然而，常规的SPRI受到需要多个样品/液体操纵的限制。此后，已经开发出了各种策略使SPRI自动化16，但是大多数定制的POC方法都需要某种形式的微设备13，17-19，这对于低资源的配置并不适合。其他现代的NA分离方法20包括使用电脉冲来操纵细胞裂解、NA分离和浓缩。但是，这些方法仍在很大程度上是概念验证和/或需要非常专业的设备，在SPRI的某些迭代中，已经探索了各种形式的微粒表面修饰。这些修饰包括羧酸11、纤维素14，15、二氧化硅(Boom方法的扩展)和壳聚糖13。通常，具有正电荷(阳离子)官能团的生物相容性基质可用于NA分离。另外，一些利用DNA功能化塑料表面的策略包括非特异性的物理吸附21。但是，NA的物理吸附通常在NA测定法中起相反的作用，因为它减少了生物分析靶标的可用性。本公开通过提供与低资源和/或POC应用相容的更简单的核酸固相可逆固定方法来解决或至少部分缓解了这些问题。
技术实现思路
在本文公开的一个方面，提供了一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法，所述方法包括：(a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下，将样品暴露于热塑性聚合物基质，(b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下，洗涤(a)中结合核酸的基质；和(c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液，从而从基质中回收核酸；其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。在另一方面，提供了一种包含通过本文公开的方法回收的核酸的组合物。在另一方面，提供了一种用于从含有核酸的样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)如本文所述的热塑性聚合物基质；(b)如本文所述的洗脱缓冲液；和(c)任选地，如本文所述的细胞裂解缓冲液；其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。在另一方面，提供了如本文所述的热塑性聚合物基质，其用于根据本文公开的方法从含有核酸的样品中分离核酸，其中当暴露于样品时，热塑性聚合物基质具有净负电荷。附图说明图1A显示了使用基于PLA的3D打印的DipStix从裂解物质中分离核酸(DNA)的一般方法和步骤。图1B是通过HeLa细胞基因组DNA(LINE1靶序列)的等温重组酶聚合酶扩增(RPA)制备的DNA扩增产物(扩增子)的凝胶图像，显示不同的热塑性3D打印基质能够从裂解物质中分离DNA，用于随后的DNA扩增。图B的顶部提供了所使用的热塑性3D打印基质的类型及其制造商，(+)：阳性样品。(-)：无DNA对照。DNA条带大小如所示。图2显示了DipStix在复合样品中的性能和应用。(A)使用BRAF和LINEl引物的qPCRCt值作为DNA浓度的函数。顶部线代表BRAF扩增子(DNA扩增产物)，而底部线代表LINE1扩增子；误差条表示SD(n＝2)。(B)从7个独立的DipStix分离的DNA的可重复qPCRCt值，其中使用10ng/μL召唤(call)裂解物；误差条表示SD(n＝7)。(C)通过RPA从粗细胞裂解物中扩增的LINE1和BRAF序列的凝胶图像。(D)与Trizol提取的总RNA相比，来自粗细胞裂解物的miRNA和mRNA靶标的RT-qPCR图谱；从左至右：miR200a、miR15a、RNU6b、肌动蛋白和Her3。(E)从颊拭子和全血细胞的粗裂解物中通过RPA扩增的LINE1序列的凝胶图像(NoT＝无靶标对照)。(F)比较DipStix分离的DNA和直接添加到PCR反应中的1μL粗植物裂解物之间PCR性能的凝胶图像。使用了拟南芥和番茄叶。图3A显示了在将Dipstix暴露于含DNA的裂解缓冲液中1秒至5分钟的时间后，产生的RPA扩增子的代表性凝胶图像。图3B显示了将Dipstix暴露于含DNA的裂解缓冲液5分钟的时间、在水中浸入1秒洗涤5次、并通过快速(瞬时)浸入(t＝-0)至120分钟洗脱至PCR缓冲液中一段时间后，产生的RPA扩增子的平均Ct值(右图)；包括已知量的DNA标准品，以估算可用于PCR的DNA量(参见左图)。图3C显示了将Dipstix暴露于含DNA的裂解缓冲液5分钟、并在水(左柱)或PCR缓冲液(右柱)中洗涤约0.1分钟至60分钟的时间、然后洗脱至PCR缓冲液中5分钟后，生成的RPA扩增子的平均Ct值。图3D显示了将Dipstix暴露于含有递增浓度的盐酸胍(GuHCl)的含DNA裂解缓冲液后生成的RPA扩增子的平均Ct值。图3E显示了作为表面积的函数的DNA结合至热塑性聚合物基质的效率，将打印的直径为1、2、3mm的DipStix浸入含DNA的溶液中生成的RPA扩增子的代表性凝胶图像(左图)，和平均直径为2mm的DipStix浸入含DNA的溶液中5、2.5和1.25mm时生成的RPA扩增子的代表性凝胶图像。图3F显示了将热塑性聚合物基质的打印分辨率提高到高达400μm之后产生的RPA扩增子的平均Ct值，注意到增加的打印分辨率增加了热塑性聚合物基质的表面积。图3G显示了在60x(顶部图)和5000x(底部图)的放大倍数下，二氯甲烷(DCM)处理的和未处理的DipStix的扫描电子显微镜(SEM)图像；显示了比例尺。图3H是来自图3G中所示的白框的放大的SEM图像(参见未处理的，60x放大倍数；顶图)，其显示了打印层之间的结构。图3I显示了使用由两台不同的3D打印机(打印1，打印2)制造的经DCM处理的和未处理的DipStix，从含DNA的裂解物中分离的DNA的RPA扩增子的代表性凝胶图像；DNA标记物显示在最左侧，而阴性对照(无DNA)显示在最右侧。图3J显示了位于热塑性聚合物基质的打印层之间的Cy5-寡核苷酸(oligo)的荧光成像。(H)图3K显示了在DNA分离步骤中Dipstix的荧光成像：(i)浸入具有Cy5-寡核苷酸的含DNA的裂解缓冲液后；(ii)用水洗涤后，和(iii)浸入PCR洗脱缓冲液后。(I)图3L是浸入水(左)或包含蓝色染料的裂解缓冲液(右)中的DipStix的照片，显示溶液沿DipStix的吸收(wicking)。图4是提出的核酸可与热塑性聚合物基质结合的机制的示意图，显示由于在提取(分离)、洗涤和洗脱阶段改变缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法，所述方法包括：/n(a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下，将样品暴露于热塑性聚合物基质；/n(b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下，洗涤(a)中结合核酸的基质；和/n(c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液，从而从基质中回收核酸；/n其中，所述热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170727 AU 20179029501.一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法，所述方法包括：
(a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下，将样品暴露于热塑性聚合物基质；
(b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下，洗涤(a)中结合核酸的基质；和
(c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液，从而从基质中回收核酸；
其中，所述热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述热塑性聚合物基质选自聚酰胺、聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、和前述任何一种的复合材料或合金。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述复合材料或合金包含聚乳酸。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和金属的合金。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述金属选自铜和铝。


6.根据权利要求3所述的方法，其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和碳的复合材料。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、尿液、精液、羊水和脊髓液。


9.根据权利要求7所述的方法，其中所述生物样品是细胞裂解物。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述样品包括离液盐。


11.根据权利要求10所述的方法，其中所述样品包含离液盐，所述离液盐的量为约375mM至约6M。


12.根据权利要求11所述的方法，其中(a)中细胞裂解物包含离液盐，所述离液盐的量为约1.5M。


13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述离液盐是盐酸胍。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述热塑性聚合物基质具有平均直径为约1mm至约3mm的细长结构。


15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述热塑性聚合物基质具有长度为约1至约30mm的细长结构。


16.根据权利要求15所述的方法，其中所述热塑性聚合物基质具有约10mm至约15mm的长度。


17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约5分钟的时间。


18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约1分钟的时间。


19.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约30秒的时间。


20.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约1秒的时间。


21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中将样品暴露于所述热塑性聚合物基质包括将所述热塑性聚合物基质浸入所述样品中。


22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在水中洗涤结合核酸的基质。


23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(b)包括在水中洗涤结合核酸的基质约5秒至约1分钟的时间。


24.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(b)包括将结合核酸的基质浸入水中。


25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液是PCR缓冲液。


26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液约0.5秒至约5分钟的时间。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·J·H·威，W·安德森，Y·S·格雷瓦尔，
申请(专利权)人：星技术有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU