一种基于TdT信号放大的结直肠癌外泌体检测方法和体系技术

本发明专利技术属于医学检测技术领域，具体为一种基于TdT信号放大的结直肠癌外泌体检测方法和体系。本发明专利技术采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）对引物探针3’ 端进行链延伸反应，催化聚合产生长链生物素修饰的polyA；然后结合亲和素修饰的辣根过氧化物酶，催化3,3',5,5'‑四甲基联苯胺（TMB）进行显色反应，并在450 nm处产生紫外吸收峰。本发明专利技术可以用于临床血清样本的检测，并成功区分结直肠癌患者血清和正常人血清。本发明专利技术的方法具有快速高效、特异性强、灵敏度高，生物相容性好，可视化程度高，且不需要大型仪器设备和昂贵试剂，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于TdT信号放大的结直肠癌外泌体检测方法和体系
本专利技术属于医学检测
，具体涉及一种基于（末端脱氧核苷酸转移酶）TdT信号放大的结直肠癌外泌体的检测方法和体系。
技术介绍
液体活检作为体外诊断的一个分支，是指通过对血液、尿液和唾液等体液进行检测，可以实现疾病分子的鉴定。液体活检对于早期诊断、指导用药、疗效评估和疾病监测等方面有着重要的意义。根据检测物的不同，可以分为循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体检测等。外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小囊泡（直径约为30-150nm），肿瘤衍生的外泌体含有肿瘤特异性蛋白质和核酸等，可以作为潜在的疾病诊断标志物。相比于其他两种检测物，外泌体的含量高，容易富集，并且外泌体的膜结构对内部的核酸和蛋白质分子有着很好的保护作用，是继CTCs和ctDNA后又一备受关注的液体活检肿瘤标志物和治疗及预后的靶点。目前对外泌体的检测方法主要有NTA、表面增强拉曼光谱（SERS）、荧光检测和酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法。NTA利用Stockes-Einstein方程计算外泌体的流体学直径和浓度，可以实现外泌体的快速、简单检测，但是特异性低，灵敏度差；荧光检测易发生光漂白和猝灭现象，不利于信号的标记和存储；SERS技术所需要的仪器昂贵、操作复杂、不适合在短时间内处理大量样品。ELISA方法因为其检测灵敏度高、特异性强，对实验操作人员的要求低，易实现自动化操作而受到广泛关注。核酸适配体是单链DNA或者RNA，其具有类似抗体的性质，能和多种目标分子高特异性、高选择性地结合。相比于抗体，核酸适配体成本低、稳定性好并且容易修饰，被广泛用于外泌体的检测中。为了提高外泌体检测的灵敏度，基于适配体识别作用外泌体的信号放大技术被广泛报道，但是现有的大部分检测方法依赖于靶向切割位点和特定的模板序列，导致操作步骤繁琐、耗时并可能出现假阳性结果。TdT酶（末端脱氧核苷酸转移酶）是一种无需模板的DNA聚合酶，可以催化脱氧核苷酸结合到单链或者双链DNA分子3’羟基端，和其他的信号放大技术相比，无需设计复杂的引物，操作简单，反应可以在37℃下进行。目前，没有报道将TdT酶和ELISA技术相结合用于外泌体的检测中。我们建立了一种基于TdT酶的紫外信号放大的技术用于结直肠癌外泌体的可视化检测。A33（结直肠癌外泌体表面蛋白标志物）抗体作为捕获抗体，核酸适配体和引物修饰的金纳米颗粒作为信号探针，从而形成抗体-外泌体-金纳米颗粒的夹心结构。在TdT酶的作用下，引物探针的3’端进行链延伸反应形成多条生物素修饰的polyA长链，结合avidin-HRP，催化底物导致溶液的紫外吸收值发生实现对外泌体的定量检测，放大效果可达10.4倍。同时该方法可用于实际血清样本的检测，结直肠癌患者的血清样本（16例）可以和正常人的血清样本（9例）区分。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种快速、灵敏和可视化的结直肠癌外泌体的检测方法和体系。本专利技术提出的结直肠癌外泌体检测方法，是基于TdT酶信号放大技术的，具体步骤为：（1）金纳米粒子探针合成：在纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体，老化；（2）包被：按照50-150μL/孔将5-8μg/mLA33抗体加入到96孔板中，孵育一段时间，然后移除多余抗体；（3）封闭：按照150-250μL/孔将封闭液加入到96孔板中，静置孵育一段时间，然后移除封闭液，随后洗涤并拍干；（4）外泌体捕获：向每孔中加入50-150μL外泌体溶液，孵育一段时间，然后洗涤并拍干；（5）信号放大：向每孔中加入50-150μL金纳米粒子探针，孵育一段时间，然后洗涤并拍干；再加入20-60UTdT酶、8-12μL缓冲液、100-300nmol生物素修饰的dATP和16-25μL超纯水，35-40℃孵育一段时间，然后洗涤并拍干；（6）检测反应：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）加入到96孔板中，孵育一段时间，然后移除，随后洗涤并拍干，最后按照50-150μL/孔将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）单组份显色液加入到96孔板中进行显色反应；（7）终止：按照25-75μL/孔加入1-2M硫酸，终止反应；（8）读数：使用酶标仪进行读数，记录450nm处的OD值。本专利技术中，所述外泌体由如下操作得到：（1）外泌体分离纯化：培养SW480细胞并收集细胞培养上清液，使用超速离心法分离得到外泌体；（2）使用纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）对提取得到的外泌体进行定量，然后分装保存于-80℃。本专利技术步骤（1）中所述的引物序列（SEQIDNO.1）为：5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；所述的核酸适配体的序列（SEQIDNO.2）为：3’-SH-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG。本专利技术步骤（1）中，所述的金纳米粒子探针合成，其操作步骤为：将3’端修饰巯基的捕获适配体（30-50μL）和5’端修饰巯基的引物（160-220μL）通过金-硫键和金纳米颗粒（450-750μL）混合，静置过夜，再加入1-2MNaCl溶液，使其终浓度为0.1-0.2M，10000-14000rpm离心两次。本专利技术步骤（3）中，所述的封闭的操作流程为：往96孔板中加入150-250μL1%-3%BSA溶液，孵育时间为1-2h，反应温度为35-37℃；随后移除封闭液，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干。本专利技术步骤（4）中，所述的外泌体捕获的操作流程为在96孔板中加入50-150μL外泌体标准品，于35-38℃孵育反应1-2小时，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次。本专利技术步骤（5）中，所述的信号放大的操作流程为：向每孔中加入50-150μL金纳米粒子探针，35-40℃孵育1-2h，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；向每孔中加入20-60UTdT酶、8-12μL缓冲液、100-300nmol生物素修饰的dATP和16-25μL超纯水，35-40℃孵育25-35min，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干。其中，在TdT酶作用下，金纳米粒子探针中的引物序列的3’端进行链延伸反应形成多条生物素修饰的dATP长链。本专利技术步骤（6）中，所述的检测反应的操作流程为：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）加入到96孔板中，孵育25-35min后移除，随后按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干；最后按照50-150μL/孔将TMB单组份显色液加入到96孔板中35-40℃孵育8-15min。其中，avidin-HRP和dATP长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于TdT酶信号放大的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，具体步骤为：/n（1）金纳米粒子探针合成：在纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体，老化；/n（2）包被：按照50-150μL/孔将A33抗体加入到96孔板中，孵育，然后移除多余抗体；/n（3）封闭：按照150-250μL /孔将封闭液加入到96孔板中，静置孵育，然后移除封闭液，随后洗涤并拍干；/n（4）外泌体捕获：向每孔中加入50-150μL外泌体溶液，孵育，然后洗涤并拍干；/n（5）信号放大：向每孔中加入50-150μL 金纳米粒子探针，孵育，然后洗涤并拍干；再加入TdT酶、缓冲液、生物素修饰的dATP和超纯水，35-40 ℃孵育一段时间，洗涤并拍干；/n（6）检测反应：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶加入到96孔板中，孵育，然后移除，随后洗涤并拍干，最后按照50-150μL/孔将3,3',5,5'-四甲基联苯胺单组份显色液加入到96孔板中进行显色反应；/n（7）终止：按照25-75μL/孔加入1-2 M 硫酸，终止反应；/n（8）读数：使用酶标仪进行读数，记录450 nm处的OD值；/n步骤（1）中所述引物序列为SEQ ID NO. 1所示，所述核酸适配体的序列为SEQ ID NO.2所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于TdT酶信号放大的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）金纳米粒子探针合成：在纳米金溶液中加入巯基修饰的引物和核酸适配体，老化；
（2）包被：按照50-150μL/孔将A33抗体加入到96孔板中，孵育，然后移除多余抗体；
（3）封闭：按照150-250μL/孔将封闭液加入到96孔板中，静置孵育，然后移除封闭液，随后洗涤并拍干；
（4）外泌体捕获：向每孔中加入50-150μL外泌体溶液，孵育，然后洗涤并拍干；
（5）信号放大：向每孔中加入50-150μL金纳米粒子探针，孵育，然后洗涤并拍干；再加入TdT酶、缓冲液、生物素修饰的dATP和超纯水，35-40℃孵育一段时间，洗涤并拍干；
（6）检测反应：按照50-150μL/孔将亲和素修饰的辣根过氧化物酶加入到96孔板中，孵育，然后移除，随后洗涤并拍干，最后按照50-150μL/孔将3,3',5,5'-四甲基联苯胺单组份显色液加入到96孔板中进行显色反应；
（7）终止：按照25-75μL/孔加入1-2M硫酸，终止反应；
（8）读数：使用酶标仪进行读数，记录450nm处的OD值；
步骤（1）中所述引物序列为SEQIDNO.1所示，所述核酸适配体的序列为SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的金纳米粒子探针合成，其操作步骤为：将3’端修饰巯基的捕获适配体30-50μL和5’端修饰巯基的引物160-220μL，通过金-硫键和金纳米颗粒450-750μL混合，静置过夜，再加入1-2MNaCl溶液，使其终浓度为0.1-0.2M，10000-14000rpm离心两次。


3.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的封闭的操作流程为：往96孔板中加入150-250μL1%-3%BSA溶液，孵育时间为1-2h，反应温度为35-37℃；随后移除封闭液，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次，拍干。


4.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的外泌体捕获的操作流程为：在96孔板中加入50-150μL外泌体标准品，于35-38℃孵育反应1-2小时，移除液体，按照200-400μL/孔加入1×PBST，洗涤3-5次。


5.根据权利要求1所述的结直肠癌外泌体检测方法，其特征在于，步骤（5）中所述的信号放大的操作流程为：向每孔中加入50-150μL金纳米粒子探针，35-40℃孵育1-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈惠，黄志鹏，孔继烈，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31