血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种人血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒。本申请采用飞行时间质谱平台，基于核酸分子在电场中飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空中的飞行时间而获得样品分析物的精准分子量，从而检测出HPA1～29SNP突变位点信息。结合多重PCR技术、单碱基延伸技术以及基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术进行分型检测。采用本申请的检测方法、引物和试剂盒，能够对29个血小板抗原HPA‑1～29基因多态性位点进行检测。检测方法准确、稳定。

【技术实现步骤摘要】
血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，特别涉及一种人血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒。
技术介绍
人类血小板同种抗原(humanpateletalloantigens，HPA)位于血小板膜糖蛋白上，这些蛋白是由遗传决定的，HPA的基因频率在不同种族、不同区域中的分布是不同的，研究HPA的基因多态性可以为人类学和遗传学等研究提供重要依据。至2016年，共计发现35个HPA，分别位于6个血小板GP分子上。按照国际输血协会的命名原则，可将35个HPA分为29个系统(或准系统)。国内外尚无能够对HPA1～29抗原基因进行较全面检测的商品试剂盒供应。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种人血小板抗原基因分型的质谱检测方法及试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种血小板抗原基因分型的质谱检测方法，包括以下步骤：(1)准备待测DNA；(2)提供所有靶点SNP的扩增引物，使用多重PCR技术扩增含有目的SNP的DNA序列；(3)对步骤(2)获得的扩增引物用碱性磷酸酶进行纯化处理，除去未结合的dNTPs；(4)提供每个靶点SNP延伸引物，将混合好的延伸引物加入步骤(3)纯化后的产物中，以ddNTP为底物，进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅为末端一个碱基的差异；(5)纯化步骤(4)获得的单碱基延伸的产物，并将产物转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测，确定其基因型。r>进一步的，扩增引物包括正向引物和反向引物，正向引物、反向引物和延伸引物的序列如下表所示：一种血小板抗原基因的引物组合，包括：序列如SEQIDNo:1-60所示的扩增引物和序列如SEQIDNo:61-90所示的延伸引物，如下表所示：一种用于检测血小板抗原基因的试剂盒，包括上述的引物组合。进一步的，进行血小板抗原基因分型时采用多重PCR。进一步的，PCR反应体系为：每个PCR孔中加入0.5μmol/LPCR引物工作液1.0μL，RNase-freeWater0.8μL，含15mmol/LMg2+的10×Buffer0.5μL，25mmol/LMgCl20.4μL，25mmol/LdNTP0.1μL，5U/μLHotstarTaq0.2μL。进一步的，PCR程序为：一个循环95℃，2min；45个循环95℃，30sec；56℃，30sec，72℃，1min；72℃，保持5min，12℃。本申请采用飞行时间质谱平台，基于核酸分子在电场中飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空中的飞行时间而获得样品分析物的精准分子量，从而检测出SNP位点信息。结合多重PCR技术、单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术进行分型检测。采用本申请的检测方法、引物和试剂盒，能够对29个血小板抗原HPA-1～29基因多态性位点进行检测。检测方法准确、稳定。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请的实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。本实验共进行了5次引物设计及测试，完成了29个位点，完成50例血液基因组DNA样品29个位点的测试实验，并进行了一代测序验证。检测结果如下所示：1、样品准备：50例血液样品基因组DNA提取结果如下表格1所示：浓度均一化到20ng/μL后用于后续检测实验。表12、引物准备：引物设计结果如表2所示。表23、检测流程：3.1样品准备(1)待测DNA样本，浓度20-50ng/μL。(2)阳性质控样本，浓度20-50ng/μL，已知分型样品(可以是之前检测过的基因组DNA样品)。(3)阴性空白，以RNase-freeWater为NTC。(4)制作样品表格，将待测的所有样品信息进行排版，每份样品均要做2个Well。根据检测需求进行384表格排版。(5)双人复核，样品板震荡混匀，瞬时离心后，取2μL样本转移到384孔板里。注意：样本转板过程中必须逐个编号比对，双人复核取样本板名称及位置，反应板名称及位置。每次加完1板样本，再一一核对每个反应孔里都有样本，体积正常，避免错加，漏加样。3.2PCR反应(1)按照下表3配制PCR反应体系，可按实际体积多配制10％-30％的量。表3试剂名称单个反应孔的体积(μL)PCR引物工作液(0.5μM)1.0RNase-freeWater0.810×Buffer(含15mMMg2+)0.5MgCl2(25mM)0.4dNTP(25mM)0.1HotstarTaq(5U/μL)0.2Totalvolume3.0(2)配制完毕后，充分涡旋混匀，瞬时离心。(3)将PCR反应体系按需要分装到8联排管中。使用排枪加入到384反应孔里，每个孔加3μL的体系。(4)用封口膜将384孔板密封，涡旋混匀，瞬时离心，观察384孔板液面高度是否一致，若发现漏加或体积不足，再补充加入相应体积的试剂，重新封膜。注意：本实验过程中每一步反应揭开的封口膜不能重复使用。(5)将384板放置在PCR仪上，盖紧PCR仪上盖。PCR程序如下所示：95℃，2min；(95℃，30sec；56℃，30sec，72℃，1min)，45cycles；72℃，5min；12℃，Hold。选择反应体系5μL，启动反应程序。(6)反应结束后，取出384孔PCR反应板，3000rpm离心2min。注：4℃暂时保存，若当天不进行后续实验，则将反应板放置于-20℃保存。3.3碱性磷酸酶(SAP)反应(1)按照下表4配制SAP反应体系，可按实际体积多配制10％-30％的量。表4试剂名称单个反应孔的体积(μL)RNase-freeWa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血小板抗原基因分型的质谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)准备待测DNA；/n(2)提供所有靶点SNP的扩增引物，使用多重PCR技术扩增含有目的SNP的DNA序列；/n(3)对步骤(2)获得的扩增引物用碱性磷酸酶进行纯化处理，除去未结合的dNTPs；/n(4)提供每个靶点SNP延伸引物，将混合好的延伸引物加入步骤(3)纯化后的产物中，以ddNTP为底物，进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅为末端一个碱基的差异；/n(5)纯化步骤(4)获得的单碱基延伸的产物，并将产物转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测，确定其基因型。/n

【技术特征摘要】
1.一种血小板抗原基因分型的质谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)准备待测DNA；
(2)提供所有靶点SNP的扩增引物，使用多重PCR技术扩增含有目的SNP的DNA序列；
(3)对步骤(2)获得的扩增引物用碱性磷酸酶进行纯化处理，除去未结合的dNTPs；
(4)提供每个靶点SNP延伸引物，将混合好的延伸引物加入步骤(3)纯化后的产物中，以ddNTP为底物，进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅为末端一个碱基的差异；
(5)纯化步骤(4)获得的单碱基延伸的产物，并将产物转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测，确定其基因型。


2.根据权利要求1所述的血小板抗原基因分型的质谱检测方法，其特征在于：所述扩增引物包括正向引物和反向引物，正向引物、反向引物和延伸引物的序列如下表所示：











WELL
检测的基因
反向引物
正向引物
延伸引物


W1
HPA-16w
SEQIDNo:1
SEQIDNo:2
SEQIDNo:61


W1
HPA-27bw
SEQIDNo:3
SEQIDNo:4
SEQIDNo:62


W1
HPA-1
SEQIDNo:5
SEQIDNo:6
SEQIDNo:63


W1
HPA-17w
SEQIDNo:7
SEQIDNo:8
SEQIDNo:64


W1
HPA-7w
SEQIDNo:9
SEQIDNo:10
SEQIDNo:65


W1
HPA-8w
SEQIDNo:11
SEQIDNo:12
SEQIDNo:66


W1
HPA-14w
SEQIDNo:13
SEQIDNo:14
SEQIDNo:67


W1
HPA-24bw
SEQIDNo:15
SEQIDNo:16
SEQIDNo:68


W1
HPA-26bw
SEQIDNo:17
SEQIDNo:18
SEQIDNo:69


W1
HPA-15
SEQIDNo:19
SEQIDNo:20
SEQIDNo:70


W1
HPA-21w
SEQIDNo:21
SEQIDNo:22
SEQIDNo:71


W1
HPA-22bw
SEQIDNo:23
SEQIDNo:24
SEQIDNo:72


W1
HPA-28bw
SEQIDNo:25
SEQIDNo:26
SEQIDNo:73


W1
HPA-6_1
SEQIDNo:27
SEQIDNo:28
SEQIDNo:74


W1
HPA-13w
SEQIDNo:29
SEQIDNo:30
SEQIDNo:75


W1
HPA-23bw
SEQIDNo:31
SEQIDNo:32
SEQIDNo:76


W1
HPA-18w
SEQIDNo:33
SEQIDNo:34
SEQIDNo:77


W1
HPA-10w
SEQIDNo:35
SEQIDNo:36
SEQIDNo:78


W1
HPA-2
SEQIDNo:37
SEQIDNo:38
SEQIDNo:79


W1
HPA-5
SEQIDNo:39
SEQIDNo:40
SEQIDNo:80


W2
HPA-19w
SEQIDNo:41
SEQIDNo:42
SEQIDNo:81


W2
HPA-3
SEQIDNo:43
SEQIDNo:44
SEQIDNo:82


W2
HPA-20w
SEQIDNo:45
SEQIDNo:46
SEQIDNo:83


W2
HPA-9w
SEQIDNo:47
SEQIDNo:48
SEQIDNo:84


W2
HPA-11w
SEQIDNo:49
SEQIDNo:50
SEQIDNo:85


W2
HPA-4
SEQIDNo:51
SEQIDNo:52
SEQIDNo:86


W2
HPA-6_2
SEQIDNo:53
SEQIDNo:54
SEQIDNo:87


W2
HPA-29bw
SEQIDNo:55
SEQIDNo:56
SEQIDNo:88


W2
HPA-25bw
SEQIDNo:57
SEQIDNo:58
SEQIDNo:89


W2
HPA-12w
SEQIDNo:59
SEQIDNo:60
SEQIDNo:90








3.一种血小板抗原基因分型的引物组合，其特征在于包括：序列如SEQIDNo:1-60所示的扩增引物和序列如SEQIDNo:61...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁文飙，朱毅，吕红，刘成成，周小玉，张若洋，周春，王静，项汉城，汤丁洁，孙少岩，詹彤，濮星，胡健，唐宁，朱爱宁，洪轲，石宇鹏，
申请(专利权)人：江苏省血液中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32