适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及测序方法技术

本发明专利技术涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。本发明专利技术针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计了具有通用结合序列的扩增子引物、具有与通用结合序列匹配的哑铃型引物，并基于这两种特殊结构的引物提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，通过该方法建库，仅需在进行常规扩增后增加2个循环的环形引物扩增，即可实现测序接头的添加，同时，通过损伤修复酶的作用，使PCR产物成为适用于PacBio测序平台的标准文库。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与修复，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，显著降低了测序成本。

【技术实现步骤摘要】
适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及测序方法
本专利技术涉及高通量测序文库构建
，更具体地，涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。
技术介绍
扩增子为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段。更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。扩增子测序是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。扩增子测序主要包括16SrDNA测序、18SrDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。16S/18SrDNA包含可变区和保守区，原核微生物的16SrDNA基因长度约为1500bp，真核微生物18SrDNA基因长度约为1500-2000bp。保守区在菌种间差异不大，可反映物种间的亲缘关系，高变区具有属或种的特异性，根据物种亲缘关系不同而有一定的差异。因此16S/18SrDNA成为了国际公认的微生物系统发育和分类鉴定的指标。ITSl是位于真核生物的18SrRNA和5.8SrRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核生物的5.8SrRNA和28SrRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18SrRNA、5.8SrRNA和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研宄。根据保守区序列设计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。传统16S/18S扩增子测序仅针对16S/18SrDNA的单个或连续的两到三个可变区进行测序与分析，而基于三代测序平台PacBio的全长16S/18S扩增子测序可轻松读取微生物16S/18SrDNA全长序列，突破了二代测序读长较短的局限性，提高了菌株在种水平的分辨能力，真正精确到“种”的分类鉴定。全长扩增子测序获得全部变异区域序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更加真实的还原样本中微生物的群落结构。微生物核糖体小亚基SSUrRNA可变区的测序分析方法被广泛应用于环境微生物多样的研究，16SrRNA基因、18SrRNA基因和ITS基因也是进行系统发育和分类研究时最常用的分子标记物。近年来，随着高通量测序技术及数据分析方法的不断进步，大量基于扩增子测序技术的研究在微生物生态学中得到了迅速的发展。但限于Illumina平台的短片段测序长度的限制，基于该平台对部分高变区的测序分析很难将物种精确鉴定到属以下的分类水平。基于PacBioSMRT单分子测序技术的超长读长优势，开发了覆盖全长核糖体小亚基16SrRNA基因、18SrRNA基因和ITS基因的高通量测序分析技术，解决了Illumina平台短读长的只能针对部分可变区进行分析的技术难题，在最优成本的基础上，实现了菌群分类的精准鉴定。与此同时，基于CCSReads的原始错误矫正，可获取精确度在99％以上的全长序列。16SrDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研宄表明，V4靶基因区域(约300bp)对微生物进行分类较为准确。
技术实现思路
针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法，本专利技术的建库方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与修复，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，提升了工作效率，降低了测序成本。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的是提出一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，包括针对单个待测样本设计的：(1)上游引物，所述上游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的F端通用结合序列、上游标签序列、F端通用引物；(2)下游引物，所述下游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的R端通用结合序列、下游标签序列、R端通用引物；(3)哑铃型引物，所述哑铃型引物包括3’端的单链结合序列和5’端哑铃型颈环结构的接头序列，所述单链结合序列与R端通用结合序列反向互补；所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配；所述F端通用结合序列与R端通用结合序列反向互补；上游标签序列与下游标签序列反向互补；F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合。进一步地，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。本专利技术的第二个目的是提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，包括以下步骤：(1)以上述任一项的上游引物、下游引物分别扩增对应样本全长目标片段；各个样本对应引物的标签序列各不相同；各个样本对应引物的F端通用结合序列相同、R端通用结合序列相同，各个样本对应引物的F端通用引物相同、R端通用引物相同；(2)将步骤(1)获取的若干个样本的扩增产物混样；(3)混合扩增产物以上述任一项的哑铃型引物进行环形引物扩增获得测序接头连接产物；环形引物扩增反应所使用的聚合酶具有5’→3’聚合酶活性而不具有5’→3’外切酶活性；(4)测序接头连接产物损伤修复获得获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库。进一步地，步骤(2)中若干个样本的扩增产物等摩尔混样。进一步地，步骤(2)中混合扩增产物总量大于或等于1μg。进一步地，环形引物扩增反应所使用的聚合酶为DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段。进一步地，所述方法还包括文库质检以确定文库大小。本专利技术的三个目的是提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子测序方法，包括采用上述任一项所述的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计了具有通用结合序列的扩增子引物、具有与通用结合序列匹配的哑铃型引物，并基于这两种特殊结构的引物提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法。通过该方法建库，仅需在进行常规扩增后增加2个循环的环形引物扩增，即可实现测序接头的添加，同时，通过损伤修复酶的作用，使PCR产物成为适用于PacBio测序平台的标准文库。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与修复，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程。(2)本专利技术的建库方法仅需要3个小时即可完成文库的构建，原官方流程建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，其特征在于，包括针对单个待测样本设计的：/n(1)上游引物，所述上游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的F端通用结合序列、上游标签序列、F端通用引物；/n(2)下游引物，所述下游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的R端通用结合序列、下游标签序列、R端通用引物；/n(3)哑铃型引物，所述哑铃型引物包括3’端的单链结合序列和5’端哑铃型颈环结构的接头序列，所述单链结合序列与R端通用结合序列反向互补；所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配；/n所述F端通用结合序列与R端通用结合序列反向互补；上游标签序列与下游标签序列反向互补；F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，其特征在于，包括针对单个待测样本设计的：
(1)上游引物，所述上游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的F端通用结合序列、上游标签序列、F端通用引物；
(2)下游引物，所述下游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的R端通用结合序列、下游标签序列、R端通用引物；
(3)哑铃型引物，所述哑铃型引物包括3’端的单链结合序列和5’端哑铃型颈环结构的接头序列，所述单链结合序列与R端通用结合序列反向互补；所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配；
所述F端通用结合序列与R端通用结合序列反向互补；上游标签序列与下游标签序列反向互补；F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合。


2.根据权利要求1所述的一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，其特征在于，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。


3.一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以权利要求1-2任一项的上游引物、下游引物分别扩增对应样本全长目标片段；各个样本对应引物的标签序列各不相同；各个样本对应引物的F端通用结合序列相同、R端通用结合序列相同，各个样本对应...

【专利技术属性】
技术研发人员：方涛，
申请(专利权)人：武汉菲沙基因信息有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42