本发明专利技术涉及启动子领域，特别是指一种脂肪酸诱导型启动子及其应用。具体为该启动子能够被脂肪酸诱导起始转录，即能诱导可操作地被连接到其上的目的基因的转录和表达，有利于目标RNA和蛋白的可控生产，最终实现在酿酒酵母中进行脂肪酸代谢的调控。一种脂肪酸诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的任一种。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，且其表达情况受到细胞生长状况及外界温度等的影响，本发明专利技术采用参比质粒与受调控质粒共同转入同一株工程菌株的方法，来考察菌株荧光蛋白的表达情况。
【技术实现步骤摘要】
一种脂肪酸诱导型启动子及其应用
本专利技术涉及启动子领域，特别是指一种脂肪酸诱导型启动子及其应用。
技术介绍
脂肪酸是一种重要的化合物，其衍生而来的脂类、烷烃类及醇类等具有重要的理论及应用价值。目前，脂肪酸的原材料主要来源于化石原材料的提取，利用微生物等工程菌株可实现脂肪酸的生物合成，但是由于微生物体内合成的天然脂肪酸往往是倾向于链长较长的脂肪酸，如以16碳及18碳脂肪酸偏多。如何能够更好的控制微生物工程菌株所合成脂肪酸的链长问题还一直处于不断的研究阶段。酿酒酵母遗传背景清晰，被认为是生物安全型菌株并广泛应用于生产实践中。同时酿酒酵母作为模式微生物由于其可在较低的pH条件下（pH≥3）生长，其具有一定发酵并生产有机酸的优势。因此本专利技术选用酿酒酵母BY4741为研究对象，筛选其本身能够响应脂肪酸的启动子，以期对其后续脂肪酸合成途径进行调控。目前国内外对于响应脂肪酸的启动子报道较少，其中最主要的是在大肠杆菌中发现的启动子，由于酿酒酵母脂肪酸合成途径的调控机制尚未研究清楚，在酿酒酵母中还未见有响应脂肪酸启动子方面的相关报道。因此本专利技术的目的为通过转录组测序的方法寻找酿酒酵母可以响应不同链长脂肪酸的启动子序列，为后续的脂肪酸途径的动态调控奠定基础。本专利技术通过对酿酒酵母中响应脂肪酸启动子的筛选及鉴定过程中，利用绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白较为准确的对脂肪酸响应启动子进行筛选，并且具有较好的重复性，得到能够响应脂肪酸的启动子，其中响应脂肪酸并促进基因表达型启动子6条，响应脂肪酸并抑制基因表达型启动子3条。这些启动子对不同链长的脂肪酸展现不同的偏好性。
技术实现思路
本专利技术提出一种脂肪酸诱导型启动子及其应用，具体为利用该启动子在酿酒酵母中进行脂肪酸代谢的调控。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，且其表达情况受到细胞生长状况及外界温度等的影响，本专利技术采用参比质粒与受调控质粒共同转入同一株工程菌株的方法，来考察菌株荧光蛋白的表达情况。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种脂肪酸诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8或SEQIDNO：9所示的任一种。含有所述的脂肪酸诱导型启动子质粒载体的构建方法，步骤为：将启动子克隆到载体PmCherry-leu2中，替代其启动子GPD1制得启动子质粒载体。含有所述的脂肪酸诱导型启动子质粒载体的基因工程菌的构建方法，步骤为：首先将外源基因eGFP克隆到载体PRS316，制备绿色荧光重组载体，然后将启动子质粒载体和绿色荧光重组载体同时转入酿酒酵母中，通过营养缺陷型培养基筛选基因工程菌。所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4741或BY4742。所述营养缺陷是指在SC-Ura-Leu营养缺陷型培养基上培养并筛选。所构建的基因工程菌的应用，作为诱导荧光蛋白表达，检测脂肪酸在酿酒酵母中代谢含量变化的应用，步骤为：将脂肪酸分别加入到已接种工程菌的液体培养基中培养，诱导荧光蛋白表达，然后使用荧光分光光度计检测其中红色荧光与绿色荧光的值，并计算两者的比值。所述脂肪酸的含量为0.5-1mM。所述培养条件为：将工程菌的种子液按照OD600为0.02-0.05的接种量接种到SC液体培养基中，28-30℃，180r/min培养14-16h。本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术通过对酵母菌株的启动子进行筛选，得到一系列能够响应不同链长脂肪酸的启动子。由图4可以看出：1、2、3、6、7、9号启动子对脂肪酸的响应表现为促进基因表达，4、5、8号启动子对脂肪酸的响应表现为抑制基因表达。进一步对启动子进行分析发现，由图5可以看出：1、6号启动子对链长C4-C10的脂肪酸有响应，2、3、9号启动子对链长C4-C16的脂肪酸有响应，4、7号启动子对链长C10-C16的脂肪酸有响应，5号启动子对链长C4-C12的脂肪酸有响应，8号启动子对链长C4-C8的脂肪酸有响应。因此，当目的基因与1、2、3、6、7、9号启动子组合时，当有上述脂肪酸存在的情况下，该目的基因的表达被促进；当目的基因与4、5、8号启动子组合时，当有上述脂肪酸存在的情况下，该基因的表达被抑制，此专利技术为基因的精准表达提供新的可参考方法。（2）本专利技术采用基因工程菌构建的方法，获得了一些能够在酿酒酵母中响应脂肪酸的启动子。通过将响应不同链长脂肪酸的启动子重新应用到酿酒酵母脂肪酸合成途径中，对其途径中的关键基因进行调控，如替换其关键基因前的启动子为本专利技术中的启动子，可以对酿酒酵母的脂肪酸及其脂肪酸类衍生物的生物合成途径进行动态调控，达到促进脂肪酸生物合成并减少副产物产生的作用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为启动子Pro1-Pro9基因的PCR验证图；其中，M：DNA分子标准量；1-9为启动子基因PCR。图2为eGFP基因的PCR验证凝胶电泳图；其中，M：DNA分子标准量；1为eGFP基因的PCR结果。图3为重组菌株在荧光显微镜下的发光情况。图4为9个启动子在脂肪酸诱导情况下的相对荧光值，C6代表含有6个碳原子的脂肪酸己酸，C12代表含有12个碳原子的脂肪酸十二烷酸。图5为9个启动子在不同链长脂肪酸诱导情况下的相对荧光值，P1-P9代表1-9号启动子，cont代表未加任何脂肪酸的对照菌株。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一、材料和方法LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10。YPD培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。SC-Ura营养缺陷培养基：去氨基酵母氮源（YNB）6.7g、省却营养物氨基酸混合物1.4g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、亮氨酸（10g/L）10mL、组氨酸(10g/L)2mL、色氨酸(10g/L)2mL，121℃，灭菌15min。SC-Ura-Leu营养缺陷培养基：去氨基酵母氮源（YNB）6.7g、省却营养物氨基酸混合物1.4g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、组氨酸（10g/L）2mL、色氨酸（10g/L）2mL，121℃，灭菌15min。注意：氨基酸溶液需配制成母液，过滤除菌；SC固体培养基灭菌时间不能超过15min，否则平板过软，影响划线。酿酒酵母BY4741转化方法：挑取单菌落，接种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脂肪酸诱导型启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8或SEQ ID NO：9所示的任一种。/n
【技术特征摘要】
1.一种脂肪酸诱导型启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8或SEQIDNO：9所示的任一种。
2.含有权利要求1所述的脂肪酸诱导型启动子质粒载体的构建方法，其特征在于，步骤为：将启动子克隆并连接到载体PmCherry-leu2中，替换PmCherry-leu2中的GPD1启动子制得启动子质粒载体。
3.含有权利要求2所述的脂肪酸诱导型启动子质粒载体的基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤为：首先将外源基因eGFP克隆到载体PRS316，制备绿色荧光重组载体，然后将启动子质粒载体和绿色荧光重组载体同时转入酿酒酵母中，通过营养缺陷筛选基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的脂肪酸诱导型启动子质粒载体的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述酿...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩丽，李磊，黄申，张占军，韩丹亚，何培新，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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