一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用制造技术

本公开涉及一种识别B7‑H3蛋白的抗体、一种识别B7‑H3蛋白和CD3的双特异性抗体，及其制造方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种含有抗体的肿瘤治疗剂的开发和应用
本公开涉及一种识别B7-H3蛋白的抗体及其制造方法和应用。
技术介绍
B7-H3也称为CD276，是一种I型跨膜蛋白，属于B7-CD28超家族。B7-H3胞外区包含两个串联的IgV-IgC结构域(4Ig-B7-H3，即IgV-IgC-IgV-IgC)(CollinsM，2005)，与鼠源B7-H3(2Ig-B7-H3)显示具有类似的功能(HofmeyerK，2008)。最初人们认为B7-H3作为一种共刺激分子，对CD4和CD8T细胞的增殖具有协同刺激作用，在TCR信号的存在下，选择性地增强干扰素的产生(Chapoval，Al.2001；Zhang，GB.2004)。然而，近年来的多数研究结果表明，B7-H3是一种抑制性分子，如B7-H3可抑制由抗TCR或同种异体抗原呈递细胞的抗体介导的T细胞增殖(SubWK，2003；VeenstraRG，2015)，这种抑制作用可能通过NFAT、NFkB和AP-1因子来控制(HofmeyerKA，2007)。人B7-H3蛋白具有膜结合型和可溶性两种，膜结合型B7-H3蛋白主要分布于肿瘤细胞表面，在细胞内部的细胞核、运输小体和外泌体等也有发现(IngebrigtsenVA，2012；Flem-KarlsenK，2017)。可溶性B7-H3由蛋白酶从细胞膜上水解下来，肿瘤患者血清中可以检测到高水平的可溶性B7-H3，提示B7-H3可以作为生物标志物(XieC，2016)。尽管B7-H3的mRNA转录片段可以在多种正常组织检测到(CollinsM，2005)，但证据显示B7-H3蛋白水平的表达受到严格调控，在正常组织细胞表面缺失或极低(YiKH，2009)。相反，B7-H3蛋白在肿瘤细胞表面表达上调，且与疾病严重程度正相关(ZangX，2007；SunY，2006；TekleC，2012；WangL，2013)。在非小细胞肺癌中，B7-H3蛋白的表达升高与患者预后呈现负相关(LouY，2016；DanilovaL，2016)。有报道B7-H3在成神经细胞瘤、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和培养的肿瘤干细胞上高表达(ModakS，2001；ZangX，2010)。B7-H3可能被肿瘤利用作为免疫逃避途径(HofmeyerK，2008)，在人肝细胞癌中，B7-H3表达与T细胞增殖抑制和降低干扰素-γ表达有关(SunTW，2012)，在小鼠胰腺癌模型中，B7-H3阻断导致CD8+T细胞浸润增加和明显的抗肿瘤作用(YamatoI，2009)。B7-H3在肿瘤相关上皮细胞也有表达，通常高表达水平对应恶化程度高，有研究将B7-H3的表达水平作为乳腺癌诊断指标(BachawalSV，2015)。最近有研究将B7-H3单克隆抗体标记212Pb，应用于卵巢癌治疗，临床前研究证明了B7-H3单克隆抗体可同时靶向肿瘤和肿瘤血管内皮细胞，显示出初步疗效和良好的安全性(KastenBB，2017)。另外，偶联pyrrolobenzodiazepine的B7-H3抗体也同时作用于B7-H3阳性肿瘤细胞和肿瘤血管内皮系统(SeamanS，2017)。B7-H3在肿瘤血管内皮系统中的高表达可能有助于肿瘤转移前微环境的形成并促进转移，有报道可溶性B7-H3介导肿瘤细胞中血管内皮生长因子的表达(XieC，2016)。
技术实现思路
本专利技术人以重组人B7-H3蛋白免疫小鼠，得到了多株识别人B7-H3重组蛋白的高亲和力抗体，分别结合于B7-H3的IgC结构域或IgV结构域。本专利技术抗体能够高特异性地结合B7-H3蛋白，其具有很高的亲和力，并且介导细胞杀伤作用，从而可以用于胃癌、胰腺癌等一些恶性肿瘤的诊断和治疗。本专利技术进一步将人源化的B7-H3抗体与人源化CD3抗体构建双特异抗体，该双特异抗体可有效杀伤表达B7-H3的肿瘤细胞。在一方面，本公开提供了结合人B7-H3蛋白的抗体或其抗原结合部分。在一方面，本公开提供了结合人CD3蛋白的抗体或其抗原结合部分。在一方面，本公开提供了结合人B7-H3蛋白和人CD3的双特异性抗体或其抗原结合部分。在一方面，本公开提供了编码如前述方面的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。在一方面，本公开提供了含有前述方面的核酸的载体。在一方面，本公开提供了含有前述方面的载体的细胞。根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的。在一方面，本公开提供了包含如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分或其编码核酸和药学上可接受的载体的药物组合物或试剂盒。治疗癌症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物。前述任一方面的抗体或其抗原结合片段或核酸分子或载体或细胞或药物组合物在制备用于治疗哺乳动物中癌症的药物或试剂盒中的用途。附图说明图1、HEK293细胞重组表达的人B7-H3胞外区蛋白图2、流式细胞术检测人B7-H3/CHO瞬转细胞。CHO-B7-H3-4Ig和CHO-B7-H3-IgC细胞表面分别表达全长B7-H3(B7-H3-4Ig)和B7-H3近膜区IgC结构域(B7-H3-IgC)，FACS结果显示，CHO-B7-H3-4Ig和CHO-B7-H3-IgC瞬转细胞表面分别有B7-H3或B7-H3-IgC中等水平的表达，其中灰色峰为同型抗体对照，黑线为B7-H3抗体检测到的阳性细胞或HA抗体检测到的B7-H3-IgC阳性细胞图3、ELISA筛选B7-H3阳性杂交瘤图4、FACS筛选结合B7-H3+细胞的抗体。其中灰色峰为阴性对照，黑色峰为与B7-H3+细胞结合的抗体图5、嵌合抗体对HEK293细胞的ADCC活性图6、嵌合抗体对Calu-6细胞的ADCC活性图7、抗B7-H3抗体的结合表位图8、抗B7-H3抗体人源化后与重组蛋白的结合图9、抗B7-H3人源化抗体的种属交叉反应图10、抗B7-H3人源化抗体与HEK293的结合图11、15C11人源化抗体对HEK293细胞的ADCC活性图12、抗CD3人源化抗体与人CD3的结合图13、抗CD3人源化抗体与Jurkat细胞的结合图14、B7-H3/CD3双特异抗体与人B7-H3蛋白的结合图15、B7-H3/CD3双特异抗体与人CD3蛋白的结合图16、B7-H3/CD3双特异抗体介导的T细胞杀伤作用图17、B7-H3/CD3双特异抗体对T细胞的活化作用具体实施方式I.定义在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。在一个方面，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合人B7-H3蛋白的抗体或其抗原结合部分，其包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：5-7、15-17、25-27、35-37、45-47、55-57、65-67、75-77、85-87、95-97、100-102、105-107、110-112、115-117或其任何变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO：10-12、20-22、30-32、40-42、50-52、60-62、70-72、80-82、90-92、120-122、125-127、130-132或任何变体的轻链CDR。/n

【技术特征摘要】
1.一种结合人B7-H3蛋白的抗体或其抗原结合部分，其包含选自氨基酸序列SEQIDNO：5-7、15-17、25-27、35-37、45-47、55-57、65-67、75-77、85-87、95-97、100-102、105-107、110-112、115-117或其任何变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO：10-12、20-22、30-32、40-42、50-52、60-62、70-72、80-82、90-92、120-122、125-127、130-132或任何变体的轻链CDR。


2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其包含选自氨基酸序列SEQIDNO：5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、100、105、110、115或其任何变体的重链CDR1，选自氨基酸序列SEQIDNO：6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、101、106、111、116或其任何变体的重链CDR2，选自氨基酸序列SEQIDNO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、102、107、112、117或其任何变体的重链CDR3；和/或选自氨基酸序列SEQIDNO：10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、125、130或其任何变体的轻链CDR1，选自氨基酸序列SEQIDNO：11、21、31、41、51、61、71、81、91、121、126、131或其任何变体的轻链CDR2，选自氨基酸序列SEQIDNO：12、22、32、42、52、62、72、82、92、122、127、132或其任何变体的轻链CDR3。


3.根据权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分，其包含选自氨基酸序列SEQIDNO：4、14、24、34、44、54、64、74、84、94、99、104、109、114、218或其任何变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQIDNO：9、19、29、39、49、59、69、79、89、119、124、129、220或其任何变体的轻链可变区。


4.根据前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分，其包含选自下列的重链和轻链的CDR组合：
(1)分别包含SEQIDNO：95-97的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：120-122的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(2)分别包含SEQIDNO：95-97的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：125-127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(3)分别包含SEQIDNO：95-97的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：130-132的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(4)分别包含SEQIDNO：100-102的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：120-122的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(5)分别包含SEQIDNO：100-102的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：125-127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(6)分别包含SEQIDNO：100-102的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：130-132的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(7)分别包含SEQIDNO：105-107的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：120-122的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(8)分别包含SEQIDNO：105-107的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：125-127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(9)分别包含SEQIDNO：105-107的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：130-132的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(10)分别包含SEQIDNO：110-112的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：120-122的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(11)分别包含SEQIDNO：110-112的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：125-127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(12)分别包含SEQIDNO：110-112的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：130-132的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(13)分别包含SEQIDNO：115-117的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：120-122的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(14)分别包含SEQIDNO：115-117的重链CDR1、CDR2及CDR3序列，和/或分别包含SEQIDNO：125-127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(15)分别包含SEQIDNO：115-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景坤，
申请(专利权)人：上海岺樾生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31