【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善基于Cas9的敲入策略的有效性的组合物和方法序列表本申请含有已以ASCII格式以电子方式提交且特此通过引用以其整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年11月16日,名称为0098-0002WO1_SL.txt并且大小为1,105,014字节。
本披露提供了一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该系统包含:能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9),以及与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交,并且其中该复合物在自然界中不存在。
技术介绍
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)系统是由Ishino在大肠杆菌(E.coli)中首次发现的原核生物免疫系统(Ishino等人,JournalofBacteriology[细菌学杂志]169(12):5429-5433(1987),通过引用以其整体并入本文)。该免疫系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸来提供针对病毒和质粒的免疫。另请参见Soret等人,“CRISPR-awidespreadsystemthatprovidesacquiredresistanceagainstphagesinbacteriaandarchaea[CRISPR-在细菌和古细菌中可提供对噬菌体的获得性抗性的广泛存在的系统]”,NatureReviewsMicrobiology[自然微生物学综述]6(3):181-186(200 ...
【技术保护点】
1.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该CRISPR-Cas系统包含:/na)能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9);和/nb)与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交;/n其中该复合物在自然界中不存在。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171116 US 62/587029;20180703 US 62/6936901.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该CRISPR-Cas系统包含:
a)能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9);和
b)与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交;
其中该复合物在自然界中不存在。
2.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该CRISPR-Cas系统包含:
a)能够产生粘性末端并且包含核定位序列(NLS)的Cas9效应蛋白(stiCas9);和
b)与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列的引导多核苷酸;
其中该复合物在自然界中不存在。
3.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该CRISPR-Cas系统包含:
a)编码能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9)的一个或多个核苷酸序列;和
b)编码引导多核苷酸的核苷酸序列,该引导多核苷酸与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交;
其中该复合物在自然界中不存在。
4.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该CRISPR-Cas系统包含:
a)编码能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9)的一个或多个核苷酸序列;和
b)编码引导多核苷酸的核苷酸序列,该引导多核苷酸与该stiCas9形成复合物并包含引导序列;
其中(a)和(b)的核苷酸序列在真核启动子的控制下,并且其中该复合物在自然界中不存在。
5.如权利要求1至4中任一项所述的CRISPR-Cas系统,其中该引导多核苷酸包含tracrRNA序列。
6.如权利要求1至4中任一项所述的CRISPR-Cas系统,该CRISPR-Cas系统进一步包含含有tracrRNA序列的单独的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的CRISPR-Cas系统,其中该引导多核苷酸、tracrRNA序列和该stiCas9能够形成复合物,并且其中该复合物在自然界中不存在。
8.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该系统包含一个或多个载体,该一个或多个载体包含:
a)可操作地连接至一个或多个核苷酸序列的调节元件,该核苷酸序列编码能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9);和
b)与该stiCas9形成复合物并包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交;
其中该复合物在自然界中不存在。
9.一种非天然存在的CRISPR-Cas系统,该系统包含一个或多个载体,该一个或多个载体包含:
a)可操作地连接至一个或多个核苷酸序列的调节元件,该核苷酸序列编码能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9),其中该调节元件是真核调节元件;和
b)与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列的引导多核苷酸;
其中该复合物在自然界中不存在。
10.如权利要求8或权利要求9所述的非天然存在的载体,其中该引导多核苷酸进一步包含tracrRNA序列。
11.如权利要求9或权利要求10所述的非天然存在的载体,该载体进一步包含含有tracrRNA序列的核苷酸序列。
12.如权利要求1至11中任一项所述的系统,其中该复合物能够在前间区序列邻近基序(PAM)的10个核苷酸内的位点处裂解。
13.如权利要求1至12中任一项所述的系统,其中该复合物能够在前间区序列邻近基序(PAM)的5个核苷酸内的位点处裂解。
14.如权利要求1至13中任一项所述的系统,其中该复合物能够在前间区序列邻近基序(PAM)的3个核苷酸内的位点处裂解。
15.如权利要求1至14中任一项所述的系统,其中该靶序列是前间区序列邻近基序(PAM)的5’并且该PAM包含富含3’G的基序。
16.如权利要求1至15中任一项所述的系统,其中该靶序列是前间区序列邻近基序(PAM)的5’,并且该PAM序列是NGG,其中N是A、C、G或T。
17.如权利要求1至16中任一项所述的系统,其中这些粘性末端包含具有3至40个核苷酸的单链多核苷酸突出端。
18.如权利要求1至17中任一项所述的系统,其中这些粘性末端包含具有4至20个核苷酸的单链多核苷酸突出端。
19.如权利要求1至18中任一项所述的系统,其中这些粘性末端包含具有5至15个核苷酸的单链多核苷酸突出端。
20.如权利要求1至19中任一项所述的系统,其中该stiCas9源自具有II-B型CRISPR系统的细菌物种。
21.如权利要求1至20中任一项所述的系统,其中该stiCas9包含与SEQIDNO:10-97或192-195中的任一个具有至少95%同一性的结构域。
22.如权利要求1至21中任一项所述的系统,其中该stiCas9包含以1E-5的E值截止值匹配TIGR03031蛋白家族的结构域。
23.如权利要求1至22中任一项所述的系统,其中该stiCas9包含以1E-10的E值截止值匹配该TIGR03031蛋白家族的结构域。
24.如权利要求23所述的系统,其中该细菌物种是嗜肺军团菌、新凶手弗朗西斯菌、γ变形菌HTCC5015、人粪便副萨特氏菌、华德萨特氏菌、硫磺单胞菌属物种SCADC、瘤胃杆菌属物种RM87、伯克霍尔德氏菌目细菌1_1_47、拟杆菌门口腔分类群274菌株F0058、产琥珀酸沃廉氏菌、伯克霍尔德氏菌目细菌YL45、嗜淀粉瘤胃杆菌、弯曲杆菌属物种P0111、弯曲杆菌属物种RM9261、拉尼尔弯曲杆菌菌株RM8001、拉尼尔弯曲杆菌菌株P0121、鼠毛滴虫、伦敦军团菌、沙姆盐弧菌、钩端螺旋体属物种分离株FW.030、钩里特拉氏菌属物种分离株NORP46、内生单胞菌属物种S-B4-1U、喜盐泰米尔纳德菌、需钠弧菌、斯氏弓形杆菌、蜃楼弗朗西斯氏菌、西班牙弗朗西斯氏菌或嗜盐副内生单胞菌。
25.如权利要求24所述的系统,其中该靶序列是前间区序列邻近基序(PAM)的5’,并且该PAM序列是YG,其中Y是嘧啶,并且该stiCas9源自细菌物种新凶手弗朗西斯菌。
26.如权利要求1至25中任一项所述的系统,其中该stiCas9包含一个或多个核定位信号。
27.如权利要求1至26中任一项所述的系统,其中该真核细胞是动物或人类细胞。
28.如权利要求1至27中任一项所述的系统,其中该真核细胞是人类细胞。
29.如权利要求1至26中任一项所述的系统,其中该真核细胞是植物细胞。
30.如权利要求1至29中任一项所述的系统,其中该引导序列与同向重复序列连接。
31.一种递送颗粒,该递送颗粒包含如权利要求1至30中任一项所述的系统。
32.如权利要求31所述的递送颗粒,其中该stiCas9和该引导多核苷酸以复合物存在。
33.如权利要求32所述的递送颗粒,其中该复合物进一步包含含有tracrRNA序列的多核苷酸。
34.如权利要求32或22所述的递送颗粒,该递送颗粒进一步包含脂质、糖、金属或蛋白质。
35.一种囊泡,该囊泡包含如权利要求1至30中任一项所述的系统。
36.如权利要求35所述的囊泡,其中该stiCas9和该引导多核苷酸以复合物存在。
37.如权利要求36所述的囊泡,该囊泡进一步包含:含有tracrRNA序列的多核苷酸。
38.如权利要求35至37中任一项所述的囊泡,其中该囊泡是外泌体或脂质体。
39.如权利要求5至9中任一项所述的系统,其中对编码该stiCas9的一个或多个核苷酸序列进行密码子优化以在真核细胞中表达。
40.如权利要求5至30或39中任一项所述的系统,其中该编码Cas9效应蛋白的核苷酸序列和该引导多核苷酸在单个载体上。
41.如权利要求5至30或39中任一项所述的系统,其中该编码Cas9效应蛋白的核苷酸序列和该引导多核苷酸是单个核酸分子。
42.一种病毒载体,该病毒载体包含如权利要求5至30或39至41中任一项所述的系统。
43.如权利要求42所述的病毒载体,其中该病毒载体是腺病毒、慢病毒或腺相关病毒载体。
44.一种包含CRISPR-Cas系统的真核细胞,该真核细胞包含
a)能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9),以及
b)与该stiCas9形成复合物并且包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交;
其中该复合物在自然界中不存在。
45.一种包含CRISPR-Cas系统的真核细胞,该CRISPR-Cas系统包含能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9),其中该Cas9效应蛋白源自具有II-B型CRISPR系统的细菌物种。
46.一种用于在真核细胞中提供靶序列的位点特异性修饰的方法,该方法包括:
a)将以下引入到该细胞中:
i.能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9);和
ii与该stiCas9形成复合物并包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交;
其中该复合物在自然界中不存在;以及
b)用该Cas9效应蛋白和该引导多核苷酸在该靶序列中产生粘性末端;以及
c)
i.将这些粘性末端连接在一起,或者
ii将目的多核苷酸序列(SoI)与这些粘性末端连接;
从而修饰该靶序列。
47.一种用于在真核细胞中提供靶序列的位点特异性修饰的方法,该方法包括:
a)将以下引入到该细胞中:
i.编码能够产生粘性末端的Cas9效应蛋白(stiCas9)的核苷酸序列;和
ii与该stiCas9形成复合物并包含引导序列的引导多核苷酸,其中该引导序列能够与真核细胞中的靶序列杂交,但不与细菌细胞中的序列杂交;
其中该复合物在自然界中不存在;以及
b)用该Cas9效应蛋白和该引导多核苷酸在该靶序列中产生粘性末端;以及
c)
i.将这些粘性末端连接在一起,或者
ii将目的多核苷酸序列(SoI)与这些粘性末端连接;
从而修饰该靶序列。
48.如权利要求46或47所述的方法,其中该引导多核苷酸进一步包含tracrRNA序列。
49.如权利要求46或47所述的方法,该方法进一步包括将包含tracrRNA序列的多核苷酸引入该细胞中。
50.如权利要求49所述的方法,其中该引导多核苷酸、tracrRNA序列与该stiCas9能够形成复合物,并且其中该复合物在自然界中不存在。
51.如权利要求46至50中任一项所述的方法,其中该复合物能够在前间区序列邻近基序(PAM)的10个核苷酸内的位点处裂解。
52.如权利要求46至51中任一项所述的方法,其中该复合物能够在前间区序列邻近基序(PAM)的5个核苷酸内的位点处裂解。
53.如权利要求46至52中任一项所述的方法,其中该复合物能够在前间区序列邻近基序(PAM)的3个核苷酸内的位点处裂解。
54.如权利要求46至53中任一项所述的方法,其中该靶序列是前间区序列邻近基序(PAM)的5’并且该PAM包含富含3’G的基序。
55.如权利要求46至54中任一项所述的方法,其中该靶序列是PAM的5’,并且该PAM序列是NGG,其中N是A、C、G或T。
56.如权利要求46至55中任一项所述的方法,其中这些粘性末端包含具有3至40个核苷酸的单链多核苷酸突出端。
57.如权利要求46至56中任一项所述的方法,其中这些粘性末端包含具有4至20个核苷酸的单链多核苷酸突出端。
58.如权利要求46至57中任一项所述的方法,其中这些粘性末端包含具有5至15个核苷酸的单链多核苷酸突出端。
59.如权利要求46至58中任一项所述的方法,其中该stiCas9源自具有II-B型CRISPR系统的细菌物种。
60.如权利要求46至59中任一项所述的方法,其中该真核细胞是动物或人类细胞。
61.如权利要求46至60中任一项所述的方法,其中该真核细胞是人类细胞。
62.如权利要求46至59中任一项所述的方法,其中该真核细胞是植物细胞。
63.如权利要求46至62中任一项所述的方法,其中该修饰是该靶序列的至少一部分的缺失。
64.如权利要求46至62中任一项所述的方法,其中该修饰是该靶序列的突变。
65.如权利要求46至62中任一项所述的方法,其中该修饰是将目的序列插入该靶序列中。
66.如权利要求46至65中任一项所述的方法,该方法进一步包括引入核酸外切酶以去除由该stiCas9产生的突出端。
67.如权利要求66所述的方法,其中该核酸外切酶是Cas4、Artemis或TREX2。
68.如权利要求67所述的方法,其中该Cas4源自具有II-B型CRISPR系统的细菌物种。
69.如权利要求46至68中任一项所述的方法,其中将编码该复合物的组分的多核苷酸引入一个或多个载体上。
70.一种将目的序列(SoI)引入细胞的染色体中的方法,其中该染色体包含含有区域1和区域2的靶序列(TSC),该方法包括将以下引入该细胞中:
a)包含靶序列的载体(TSV),该TSV包含区域2和区域1以及该SoI;
b)能够在该TSC中产生粘性末端的第一Cas9-核酸内切酶二聚体,其中该第一Cas9-核酸内切酶二聚体的第一单体在该TSC的区域1处裂解,并且该第一Cas9-核酸内切酶二聚体的第二单体在该TSC的区域2处裂解;以及
c)能够在该TSV中产生粘性末端的第二Cas9-核酸内切酶二聚体,其中该第二Cas9-核酸内切酶二聚体的第一单体在该TSV的区域2处裂解,并且该第二Cas9-核酸内切酶二聚体的第二单体在该TSV的区域1处裂解;
其中将(a)的载体、(b)的第一Cas9-核酸内切酶二聚体和(c)的第二Cas9-核酸内切酶二聚体引入该细胞中导致该SoI被插入该细胞的染色体中。
71.一种将目的序列(SoI)引入细胞的染色体中的方法,其中该染色体包含含有区域1和区域2的靶序列(TSC),该方法包括将以下引入该细胞中:
a)包含靶序列的载体(TSV),该TSV包含区域2和区域1以及该SoI,其中该载体包含粘性末端;
b)能够在该TSC中产生粘性末端的第一Cas9-核酸内切酶二聚体,其中该Cas9-核酸内切酶二聚体的第一单体在该TSC的区域1处裂解,并且该Cas9-核酸内切酶二聚体的第二单体在该TSC的区域2处裂解;
其中将(a)的载体和(b)的第一Cas9-核酸内切酶二聚体引入该细胞中导致该SoI被插入该细胞的染色体中。
72.如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中该第一和第二Cas9-核酸内切酶二聚体是相同的。
73.如权利要求70或权利要求71所述的方法,其中该第一和第二Cas9-核酸内切酶二聚体是不同的。
74.如权利要求70至73中任一项所述的方法,该方法进一步包括将第一引导多核苷酸引入该细胞中,该第一引导多核苷酸与该第一Cas9-核酸内切酶二聚体的第一单体形成复合物并且包含第一引导序列,其中该第一引导序列与该包含区域1的TSC杂交,但不与该载体杂交。
75.如权利要求70至73中任一项所述的方法,该方法进一步包括将第一引导多核苷酸引入该细胞中,该第一引导多核苷酸与该第一Cas9-核酸内切酶二聚体的第一单体形成复合物并包含第一引导序列,其中该第一引导序列与该TSC和该TSV杂交。
76.如权利要求70至75中任一项所述的方法,该方法进一步包括将第二引导多核苷酸引入该细胞中,该第二引导多核苷酸与该第一Cas9-核酸内切酶二聚体的第二单体形成复合物并包含第二引导序列,其中该第二引导序列与该包含区域2的TSC杂交,但不与载体杂交。
77.如权利要求70至75中任一项所述的方法,该方法进一步包括将第二引导多核苷酸引入该细胞中,该第二引导多核苷酸与该第一Cas9-核酸内切酶二聚体的第二单体形成复合物并包含第二引导序列,其中该第二引导序列与该TSC和该TSV杂交。
78.如权利要求70至77中任一项所述的方法,该方法进一步包括将第三引导多核苷酸引入该细胞中,该第三引导多核苷酸与该第二Cas9-核酸内切酶二聚体的第一单体形成复合物并包含第三引导序列,其中该第三引导序列与该包含区域2的TSV杂交,但不与该染色体杂交。
79.如权利要求70至78所述的方法,该方法进一步包括将第三引导多核苷酸引入该细胞中...
【专利技术属性】
技术研发人员:M马尔斯卡,A塔赫里加赫法罗基,F卡尔松,M博卢利耶加内,LM迈尔,
申请(专利权)人:阿斯利康瑞典有限公司,
类型:发明
国别省市:瑞典;SE
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